银屑病患者病灶组织、血清中抗菌肽LL-37表达变化及意义

种树彬，兰海梅，曾抗，赵学峰(南方医科大学附属南海医院，广东佛山5800;南方医科大学南方医院)

银屑病患者病灶组织、血清中抗菌肽LL-37表达变化及意义

种树彬1，兰海梅2，曾抗2，赵学峰1
(1南方医科大学附属南海医院，广东佛山528200;2南方医科大学南方医院)

摘要:目的探讨银屑病患者病灶组织与血清中抗菌肽LL-37表达变化及其意义。方法收集45例寻常型银屑病患者(观察组)和44例健康人群(健康对照组)的血清，另选取25例寻常型银屑病患者的病灶组织(试验组)和25例因创伤需自体手术植皮患者的正常皮肤组织(对照组)。血清LL-37水平检测采用ELISA法。银屑病病情严重程度采用PASI评分法判定，分析血清LL-37水平与银屑病病情严重程度及炎症因子IL-22和IFN-γ的相关性。采用Western blotting免疫印迹法和RT-PCR法检测病灶组织中LL-37蛋白及mRNA表达。结果观察组与健康对照组血清LL-37水平分别为12.3、9.43 ng/mL，两组比较，P＜0.01。观察组PASI得分平均13.7分。观察组与健康对照组血清LL-37水平与银屑病病情严重程度呈正相关(r =0.515，P＜0.001)。试验组LL-37mRNA表达约为对照组的5.1倍，LL-37蛋白表达约为对照组的5.3倍，两组LL-37mRNA及蛋白表达比较，P均＜0.01。结论银屑病患者病灶组织及血清中抗菌肽LL-37表达均显著升高，检测抗菌肽LL-37有助于评判银屑病病情严重程度。

关键词:银屑病;抗菌肽LL-37; PASI指数

银屑病是一种常见的慢性皮肤病，易反复发作。皮损的主要病理学变化是角化不全、炎症细胞浸润、血管异常增生［1］。其发病原因尚未完全明确，目前认为免疫系统紊乱起到一定作用，而炎症细胞功能改变是银屑病的潜在病因［2］。研究［3］表明由炎症细胞产生的诸多炎症因子在银屑病发病和进展中起重要作用。抗菌肽LL-37是Catheliecidin家族抗菌肽蛋白N端的37个氨基酸，因其开始的氨基酸分别为L-L而得名。最近研究发现树突状细胞及抗菌肽LL-37在银屑病的进展中有重要作用。抗菌肽LL-37具有广谱的抗微生物活性及调节免疫系统、促进损伤修复、抗肿瘤等功能［4］。2013年4月～2014年9月，我们观察了银屑病患者病灶组织、血清中LL-37表达变化，并探讨其意义。

1　资料与方法

1.1临床资料25例寻常型银屑病进展期患者［男12例、女13例，年龄(29.7±5.2)岁，BMI为(22.4±1.8)kg/m2］的病灶组织(试验组)和25例［男11例、女14例，年龄(29.9±4.9)岁，BMI为(23.1±1.6)kg/m2］因创伤需自体手术植皮患者的正常皮肤组织(对照组)用于组织学研究，两组年龄、性别、BMI具有可比性。均未接受口服药物治疗2周及外用药物治疗1周以上。排除标准:哺乳期患者、其它自身免疫性疾病、恶性肿瘤、糖尿病、肝肾功能不全、湿疹等其他皮肤病除外。将两组皮肤组织分别进行组织切割，获得真皮层及角质层皮肤样本，提取皮肤组织蛋白，立即置于RNAlater液低温保存。获取组织前患者均签署知情同意书并经医院伦理委员会同意。另选取进展期银屑病患者45例［男27例、女18例，年龄(31.8±7.4)岁，BMI(23.6 ±2.6)kg/m2］作为观察组。入选标准和排除标准同上。健康对照组选择同一时间查体健康者44例［男27例、女17例，年龄(30.9±8.1)岁，BMI(22.9 ±2.9)kg/m2］。空腹抽取两组上肢静脉血5mL，经EDTA抗凝，－80℃冰箱存放待测。

1.2血清LL-37检测分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔，采用ELISA法检测血清LL-37。操作按人LL-37、IL-22和IFN-γ试剂盒说明进行，每孔各加入稀释PBS缓冲液稀释1 000倍的待测血清10 μL，在37℃环境下温育30min;洗板5次，加入酶标试剂50 μL，混匀，37℃环境继续温育30min，洗板后加入显色剂避光显色10min。在450 nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。根据标准品的浓度及对应OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.3病灶组织中LL-37蛋白检测采用Western blotting法。将试验组和对照组皮肤组织剪切成小

块，加入适量的冰冷PBS均浆，静置5min，弃沉淀，小心吸取上清转移至另一离心管中;按常规操作步骤提取蛋白，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白;上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法)，分装并保存于－80℃，避免反复冻融。然后进行SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。5%脱脂奶粉封闭后分别与抗β-actin(1∶1 000)、抗LL-37(1∶500)进行反应。取相同体积的A、B试剂，在保鲜膜上将其充分混匀; 1min后，将膜蛋白面朝下放置，并与A、B混合液进行接触; 1min后移开膜并将其置于另一保鲜膜上，将膜上残存的混合液去掉，再将其充分包好后放入X-光片夹中。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的相对分子质量和净光密度值。

1.4病灶组织中LL-37mRNA检测总RNA的提取及逆转录从样本保存液中取出，根据RNA提取试剂盒上的操作步骤进行。RT-PCR反应。反应条件为95℃、3 s，95℃、5 s，60℃、34 s，循环40次。每标本检测2次。根据最终的优化体系，比较目的基因与内标基因扩增效率的斜率回归有无显著性差异。每次实验均重复3次以上。

1.5血清LL-37与银屑病病情严重程度的相关性

银屑病病情严重程度判定:采用PASI评分法［9］对银屑病皮疹面积和严重程度进行评分。采用Spearman相关性分析法分析血清LL-37与银屑病病情程度的关系。

1.6统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，采用两独立样本t检验法进行各组数据间的比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1观察组与健康对照组血清LL-37水平比较

观察组与健康对照组血清LL-37水平分别为12.3(9.33～17.10)、9.43(7.16～11.11)ng/mL，两组比较，P＜0.01。

2.2试验组与对照组LL-37表达比较试验组LL-37mRNA表达约为对照组的5.1倍，LL-37蛋白表达约为对照组的5.3倍，两组LL-37mRNA及蛋白表达比较，P均＜0.01。

2.3血清LL-37与银屑病病情严重程度的相关性

观察组PASI得分平均13.7分(1.98～29.81)。血清LL-37水平与银屑病病情严重程度呈正相关(r =0.515，P＜0.001)。

3　讨论

LL-37主要表达于骨髓源性细胞、组织上皮细胞、角质形成细胞及某些腺体等易与微生物接触的部位［6］。LL-37在正常人体皮肤上一般不表达或低表达，当皮肤受到外来刺激(外伤、感染、炎症等)时，LL-37表达水平即大大升高［7］。这些升高的LL-37来源包括角质形成细胞和趋化到局部的中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等。作为天然免疫的重要成分，LL-37在机体遭受外来感染源侵犯时可与其他抗菌肽一同迅速而有效地提供第一线防御［8］。研究［9］表明，LL-37不但可直接杀灭感染源，还可间接参与获得性免疫中免疫细胞的趋化、细胞因子释放及部分炎症性疾病的发生发展。

银屑病是一种炎症性皮肤病，其中Th1和Th17细胞及众多细胞因子在其发病中起到重要作用。银屑病皮损处角质形成细胞能分泌一系列趋化中性粒细胞和Th1细胞的细胞因子，这些细胞因子与IFN-γ等可调节白细胞和淋巴细胞中LL-37的转录和分泌。PASI指数是临床评价银屑病临床疗效的常用量表，具有较高的可靠性和实用性。本研究发现，抗菌肽LL-37在局部皮损和血清中的表达均显著性升高，且血清LL-37水平与PASI指数呈明显正相关性。说明LL-37在银屑病发病和进展中发挥重要作用，血清LL-37可作为评价银屑病进展的血清学指标。

参考文献:

［1］满孝勇，郑敏.银屑病发病机制的研究进展［J］.浙江大学学报(医学版)，2006，35(6): 673-677.

［2］林景荣，刘晓明.银屑病中T细胞活化与端粒酶表达的研究进展［J］.中国麻风皮肤病杂志，2006，22(12): 1006-1008.

［3］陈慰峰.医学免疫学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2001: 147-149.

［4］Zaioum，Nizet V，Gallo RL.Antimicrobial and protease inhibitory functions of the human cathelicidin(hCAP18/ LL-37)prosequence［J］.J Investdermatol，2003，120(5): 810-816.

［5］He L，Jin Z，Liu F.Elevated serum levels of interleukin 21 are associated withdisease severity in patients with psoriasis［J］.Br Jdermatol，2012，167(2): 191-193.

［6］Conner K，Nern K，Rudisill J，et al.The antimicrobial peptide LL-37 is exp ressed by keratinocytes in condyloma acuminatum and verruca vulgaris［J］.J Am Acaddermatol，2002，47(3): 347-350.

［7］Niyonsaba F，Iwabuchi K，Someya A，et al.A cathelicidin family of human antibacterial peptide LL-37 inducesmast cell chemotaxis ［J］.Immunology，2002，106(1): 20-26.

［8］Scot tmG，DavidsondJ，GoldmR，et al.The human antimicrobial peptide LL-37 is amultifunctionalmodulator of innate immune responses［J］.J Immunol，2002，169(7): 3883-3891.

［9］李方舟，胡海峰.人cathelicidin抗菌肽LL-37在宿主防御系统中的作用［J］.世界临床药物，2011，32(4): 243-246.

收稿日期:( 2015-05-10)

文章编号:1002-266X(2015)33-0087-02

文献标志码:B

中图分类号:R758.63

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.035