白细胞介素-12B基因多态性与原因不明复发性流产的相关性分析

曹玉梅，吴振兰，宋会会，赵建强，李玉洁，王振明

(1潍坊医学院，山东潍坊261042；2潍坊市人民医院)

白细胞介素-12B基因多态性与原因不明复发性流产的相关性分析

曹玉梅1，吴振兰2，宋会会2，赵建强2，李玉洁2，王振明2

(1潍坊医学院，山东潍坊261042；2潍坊市人民医院)

目的 分析白细胞介素-12B(IL-12B)基因启动子区多态性与原因不明复发性流产(URSA)的相关性。方法 URSA患者83例(URSA组)，同期门诊体检健康妇女90例(对照组)，采用RT-PCR法检测两组IL-12B基因多态性。结果 在IL-12B基因启动子区共发现2个单核苷酸多态性，即-671G/T和-405G/T，两组IL-12B基因-671G/T、-405G/T多态性分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。URSA组-671T/-405G单体型比例(0.65%)高于对照组(0.41%)，P<0.05。结论 IL-12B基因启动子区单体型-671T/-405G基因型可能与URSA发生有关。

复发性流产；白细胞介素-12B基因；单核苷酸多态性；相关性分析

原因不明复发性流产(URSA)发病率为1%～3%[1]，具体发病机制尚不清楚。白细胞介素-12(IL-12)是与免疫功能相关的细胞因子，在URSA的发生、发展过程中发挥重要作用。研究发现，IL-12B的基因启动子区多态性影响IL-12B转录，但基因多态性与URSA相关性在不同种族不尽相同[2～4]。本研究探讨IL-12B基因启动子区多态性与中国北方汉族育龄期妇女URSA的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2013年6月～2014年6月潍坊市人民医院住院URSA患者83例(URSA组)，年龄21～41(30.43±4.34)岁，均根据临床症状、现病史、既往史、家族史、查体及辅助检查等多项指标评定后确诊。另选同期门诊体检健康妇女90例作为对照组，年龄25～43(31.26±3.86)岁，妊娠均≥2次，无不良妊娠史。两组年龄具有可比性；均为中国汉族，相互间无血缘关系。

1.2 方法

1.2.1 IL-12B基因多态性检测 采用RT-PCR法。①两组分别取外周静脉血3 mL，EDTA抗凝，提取DNA。②引物设计与合成根据NCBI发表的IL-12B基因序列(GeneBank ID AY008847)，第1对引物上游：5′-TGAGGCTCAGCGAGTAACTT-3′，下游：5′-AGACCACACCTTGAGAACCA-3′，扩增长度740 bp；第2对引物上游：5′-TGCTGAATCAGACACTCTGG-3′，下游：5′-ACCAACTGCTGGTGACACAT-3′，扩增长度830 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。③ PCR扩增，反应体系25 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共循环35次；72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。④随机选取部分样品的PCR产物，进行序列测定(南京金斯瑞生物科技有限公司)，确定-671 G/T和-405 G/T位点的基因型，同时对酶切结果进行验证，以保证结果的可靠性。

1.2.2 统计学方法 采用拟合优度χ2检验，检测L-12B基因启动子区位点基因型频率、等位基因频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用在线软件平台SHEsis 分析单体型数据[5]。采用SPSS19.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

IL-12B基因启动子区位点的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。在IL-12B基因的启动子区共发现2个功能单核苷酸，即-671G/T和-405G/T，两组IL-12B基因-671G/T、-405G/T多态性分布见表1、2。-671G/T和-405G/T等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。两组-671G/T和-405G/T构成的3种单体型比较见表3。

3 讨论

IL-12作为一种炎性细胞因子，是连接早期非特异免疫反应和继发抗原特异性免疫反应的桥梁，主要由抗原激活的单核/巨噬细胞、树突细胞等抗原递呈细胞产生，通过调节Th1、Th2比例，在淋巴细胞介导的免疫过程中发挥重要作用[6,7]。IL-12是由IL-12A(P30)和IL-12B(P40)两个亚基组成。IL-12A(P30)基因易感性研究相对较少。IL-12B具有基因多态性，国内外的许多研究已经发现，IL-12B启动子、rs321309、外显子5′、3′UTR基因多态性与疾病相关。如Morahan等[8]认为，3′UTR等位基因高表达与结核病相关；周林等[9]认为，rs321309可能与宁夏人群强直性脊柱炎患病风险有关联；张雄等[10]认为，3′UTR(A>C)多态性可能是亚洲人群宫颈癌和鼻咽癌易患性增加的危险因素之一。

正常妊娠时Th1/Th2免疫反应保持平衡，母胎界面以Th2型细胞因子占主导地位，发挥免疫营养作用。当Th1/Th2比值变化向Th1偏离时，则可能损伤胎盘滋养细胞及胎儿，导致URSA患者Th1型因子分泌IL-2、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)等，介导细胞免疫、炎症反应，对胚胎生长发育不利。而IFN-γ与IL-12存在正反馈循环，IFN-γ及促进IFN-γ增加的因素都能促进IL-12产生，反之，IL-12增加亦可促进IFN-γ的产生。所以，IL-12的表达可间接导致复发性流产的发生。Wilson等[11]发现，复发性流产患者血清IL-12水平明显高于正常未孕妇女。

URSA作为一种多基因遗传病，其遗传易感性可能是由多个功能单核苷酸的遗传变异所决定，并受环境因素影响。对于多基因疾病易感基因的鉴定，虽然目前还没有最好的方法，但通过连锁分析结合关联分析及生物学功能研究，找到了一些多基因疾病的易感基因，如IL-23R是强直性脊柱炎的易感基因[12]、miR-499基因是高度宫颈上皮内瘤变的易感基因[13]、ADAM33基因是慢性阻塞性肺疾病的易感基因[14]。

本研究选取中国汉族URSA患者为研究对象，在IL-12B基因的启动子区共发现2个功能单核苷酸，即-671G/T和-405G/T，URSA组、对照组IL-12B基因-671G/T、-405G/T多态性分布差异均无统计学意义，URSA组-671T/-405G单体型比例多对照组；提示IL-12B基因启动子区的-671G/T、-405G/T基因型与URSA发生无关联，单体型-671G/-405G可能与URSA的遗传易感性有关，但其在URSA易感性中的作用和机制尚需进一步研究证实。

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吴振兰，E-mail: wuzhenlan.wf@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.025

R714.21

B

1002-266X(2015)12-0064-02

2014-08-21)