自然降尘与人体两种正常细菌的近尺寸作用分析

卢秀兰，董发勤，邓建军，代群威，曾娅莉

(1绵阳四○四医院，四川绵阳621000；2西南科技大学)

自然降尘与人体两种正常细菌的近尺寸作用分析

卢秀兰1，董发勤2，邓建军1，代群威2，曾娅莉1

(1绵阳四○四医院，四川绵阳621000；2西南科技大学)

目的 分析不同地区5种自然降尘与大肠埃希菌、表皮葡萄球菌的近尺寸作用。方法 选取5种不同性质的大气粉尘(FC-1#、FC-2#、FC-15#、FC-18#、FC-21#)，对其特性、粒径及粒度参数、主要化学成分进行分析，观察其与大肠埃希菌、表皮葡萄球菌相互作用后各培养液的细菌数、pH值、葡萄糖(GLU)消耗及Mn、Pb、Fe、Si等元素变化，以及细菌形态。结果 FC-1#含有较多的CaO；FC-2#、FC-15#、FC-18#、FC-21#含有较高SiO2；FC-1#、FC-15#烧失量(LOI)高于其他降尘。自然降尘颗粒直径为0.3～1 μm。大肠埃希菌、表皮葡萄球菌与5种自然降尘相互作用后，与未作用者比较，FC-1#、FC-21#菌落数均增加，GLU消耗均降低，pH值均增加，P<0.05或<0.01。大肠埃希菌与FC-1#作用后Fe、Ca、Ni、Si、Al溶出增加，与FC-2#作用后仅Al溶出增加，与FC-15#作用后Fe、Ca溶出增加，与FC-18#、FC-21#作用后Ca溶出增加，P<0.05或<0.01；表皮葡萄球菌与FC-1#作用后Ca、Mg、Ni、Si、Al溶出增加，与FC-2#作用后仅Al溶出增加，与FC-15#作用后Ca、Al 溶出增加，与FC-18#作用后Ca、Mg溶出增加，与FC-21#作用后Ca溶出增加，P均<0.01。细菌形态结果表明，降尘颗粒的形状不规则性增加了其与细菌间的膜界结合程度。结论 Ca含量高的碱性自然降尘对大肠埃希菌、表皮葡萄球菌的生长有促进作用；自然降尘颗粒越小，越容易与菌体结合。

自然降尘；大肠埃希菌；表皮葡萄球菌；元素

矿物细颗粒物和微生物个体都是大气颗粒物(PM)的重要组成部分，它们在形态、共存关系和空气动力学行为上均有高关联度。空气动力学直径<2.5 μm的矿物与菌体尺寸相近的微生物界膜的相互作用称之为近尺寸作用[1]。当可吸入矿物细颗粒尺寸小于亚微米级或纳米级时，二者的近尺寸作用变得异常激烈，作用区域更集中在界膜两侧，这时微生物将成为作用主体和中心，纳米表面效应会在溶解、膜黏附、穿膜、膜内作用、胞液作用和产物代谢等过程中表现出来。正常菌群不仅与人体保持平衡状态，而且菌群之间也相互制约，以维持相对的平衡。在这种状态下，正常菌群发挥其营养、拮抗和免疫等生理作用。目前，尚不明确可吸入矿物细颗粒与大气直接接触的鼻腔、口腔等器官和皮肤表面的正常菌群作用后，是否会导致微生物毒力改变、生长代谢变化，从而打破正常菌群与宿主间或正常菌群各菌种间的平衡，出现菌群失调[2～5]。2012年1月～2014年6月，我们采集不同地区的5种自然降尘，与人体两种正常细菌相互作用，研究两者的近尺寸作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 自然降尘 选取来自生活区(户内和户外)、交通地段、工业厂矿等不同性质的5种大气粉尘，FC-1#为四川省江油铁松水泥厂输送带外窗台上粉尘，FC-2#为绵阳市发电厂自然沉降粉尘，FC-15#为西南科技大学科技处室内粉尘，FC-18#为青海省西宁市南川东路汽车一厂院内(户外) 粉尘，FC-21#为甘肃省静宁仁大乡户外窗台粉尘。

1.1.2 细菌 大肠埃希菌标准菌株ATCC25922来自卫生部临床检验中心。表皮葡萄球菌分离自四川绵阳四○四医院临床菌株，由四川大学华西医院临床微生物中心鉴定。

1.2 方法

1.2.1 自然降尘和细菌的处理方法 电子天平准确称取上述5种矿物尘粒各100 mg，高压蒸气灭菌后放入10 mL普通肉汤培养液，制成浓度为10 mg/mL的尘粒悬液。两种细菌分别加入普通肉汤培养基中增菌24 h，调整细菌浓度为1×109cfu/L。

1.2.2 分组及处理方法 实验组：普通肉汤培养液3.5 mL+自然降尘悬液0.4 mL+细菌悬液0.1 mL(使尘粒终浓度为1 mg/mL)。对照组：细菌悬液0.1 mL+普通肉汤培养液3.9 mL。与大肠埃希菌37 ℃共同培养16 h，与表皮葡萄球菌37 ℃共同培养24 h；每次做平行管，重复6次。

1.2.3 观察指标及方法 以倾倒平板法计算细菌数量；混合物以4 000 r/min离心30 min，取上清液检测pH值、葡萄糖(GLU)消耗及Mn、Pb、Fe、Si等14种元素变化；SEM分析细菌与自然降尘作用后的形态变化。自然降尘组成分析采用PW1404型自动X射线荧光分析仪(荷兰Philips公司)；粒度分布测定采用Masterizer2000粒度分析仪(英国马尔文仪器公司)；GLU消耗测定采用日本日立7600型全自动生化仪；pH值分析采用Phox Plusl 急诊生化分析仪(美国NOVA公司)；形态观察采用S440型扫描电子显微镜(英国Leica公司)；微量元素测定采用Auto scan Advantge端视ICP-AES(美国TJA公司)。

2 结果

2.1 自然降尘特性 5种自然降尘主要成分分析结果见表1，颗粒直径及粒度参数分析结果见表2。FC-1#含有较多的CaO；其他含有较高的SiO2；FC-1#、FC-15#烧失量(LOI)高于其他降尘。自然降尘颗粒直径0.3～1 μm；直径<0.3 μm的室内自然降尘占6%左右，<1.0 μm的自然降尘占90%左右。

2.2 两组菌落数、GLU消耗、pH值比较 5种自然降尘与大肠埃希菌、表皮葡萄球菌相互作用后，与各自的对照组比较，FC-1#、FC-21#菌落数均增加，GLU消耗均降低，pH值均增加，P<0.05或<0.01，见表3。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 两组元素溶出情况 与对照组比较，大肠希菌与FC-1#作用后Fe、Ca、Ni、Si、Al溶出增加，与FC-2#作用后仅Al溶出增加，与FC-15#作用后Fe、Ca溶出增加，与FC-18#、FC-21#作用后仅Ca溶出增加，P<0.05或<0.01，见表4。5种自然降尘与表皮葡萄球菌相互作用后，与对照组比较，表皮葡萄球菌与FC-1#作用后Ca、Mg、Ni、Si、Al 溶出增加，与FC-2#作用后仅Al溶出增加，与FC-15#作用后Ca、Al 溶出增加，与FC-18#作用后Ca、Mg溶出增加，与FC-21#作用后仅Ca溶出增加，P均<0.01，见表5。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；Na及K为培养基主要成分，单位为×103pg/L。

注：与对照组比较，**P<0.01；Na及K为培养基主要成分，单位为×103pg/L。

2.4 细菌形态变化 ① 5种自然降尘与大肠埃希菌相互作用后细菌形态变化：对照组大肠埃希菌菌体表面光滑，菌体上存在一定凹陷，端部有短鞭毛，形态相对均一。实验组FC-1#形态为纤维状、不规则块状，大小不一，部分细菌散落在较大颗粒表面，在纤维状粉体周围团聚了许多细菌，且与自然降尘作用的细菌菌体凹陷增加，菌体变的“瘦长”。FC-2#多呈圆球形(主要是飘尘)，几个球形自然降尘颗粒之间有许多的大肠埃希菌菌体相互团聚填补其中；有部分菌体端部鞭毛变长，且其鞭毛弯曲相连，出现菌体破裂现象，留下的菌体“残骸”仍清晰可见。FC-15#形状不规则，大小不一，纤维状粉体周围团聚了许多细菌。FC-18#及FC-21#呈不规则块状、片状，在较大自然降尘颗粒表面附着有大量细小粉体，与大肠埃希菌菌体黏附，且自然降尘形成的空隙中也存在菌体，相互黏附，呈堆积生长，界面接触充分。② 5种自然降尘与表皮葡萄球菌相互作用后细菌形态变化：对照组表皮葡萄球菌菌体表面光滑，堆积成葡萄状，形态相对均一，表面有凹陷。实验组FC-1#较大条块状自然降尘表面附着大量表皮葡萄球菌菌体，而小颗粒自然降尘(300 nm左右)又多黏附于菌体表面，层层包裹，形成团状。多个菌体之间也以自然降尘聚体相黏附，细菌与自然降尘相互团聚生长。甚至可以看到有部分菌体表面完全被细小自然降尘颗粒黏附包裹。小颗粒片状自然降尘达到200 nm左右，甚至有些更为细小，呈蓬松状；在几种自然降尘的表面均附着有许多小颗粒自然降尘，同时也团聚了大量的表皮葡萄球菌菌体，而自然降尘表面凹处和自然降尘颗粒之间则“填满”了大量细菌，褶皱处有大量细菌团聚生长。大块状粉体周围附着有部分菌体，但大量菌体相互团聚，与自然降尘之间黏附程度较低。

3 讨论

自然降尘在吸入人体内部后，对人体造成的直接危害比较严重[6]；没有进入人体内部的自然降尘会附着于体表或面部，与这些部位的正常菌群发生相互作用，对人体直接危害更为严重[7]。本研究所选表皮葡萄球菌与大肠埃希菌为人体体表上具有代表性的菌株，所选自然降尘的粒径大小与两种正常细菌的大小基本相当，与细菌的界面接触程度相对较高。

矿物颗粒物的空气动力学直径≤2.5 μm被称为PM2.5。自上世纪八十年代开始，一些发达欧美国家就开始重视PM2.5，并对其开展了广泛的研究。但至目前，有关可吸入矿物细颗粒/微生物体系界膜作用过程中微生物行为的研究较少[8～10]。本研究采集的5种自然降尘95%以上为PM2.5，与大肠埃希菌及表皮葡萄球菌尺寸相近，5种自然降尘与两种细菌作用后， Mn、Pb、Zn、K、Na、Ba、Ti 及P这8种元素均未出现显著性变化，而Fe、Ca、Mg、Ni、Si、Al这6种元素则有显著性变化。FC-1#是一种碱性粉尘，本身含有大量CaO，与两种细菌作用后均能溶出大量Ca，表现出对两种细菌的生长有明显的促进作用；同时Ni、Si、Al、溶出也升高，表明与两种正常菌作用后，能促进这几种元素的溶出。FC-21#也是一种碱性粉尘，仅含有少量的CaO，但培养基Ca升高，也表现出对两种细菌生长有明显促进作用。可见含Ca钙高的碱性粉尘与细菌作用后能表现出较强的生物活性，其具体机制可能与培养基中微量元素的含量密切相关[11]。微量元素作为细菌代谢过程中代谢酶的激活剂或一些代谢酶的辅基在细菌生长代谢过程中发挥必不可少的作用。

自然降尘在与细菌作用过程中，随着细菌分解GLU的主要酸性代谢产物增加，培养基pH逐渐下降，中和自然降尘表面大部分的OH-，进而促进自然降尘的溶解，而溶解后的自然降尘会提供细菌生长代谢必需的营养元素，如矿物元素等，促进细菌的增殖[12,13]。本研究中，5种自然降尘与大肠埃希菌、表皮葡萄球菌相互作用后，与各自的对照组比较，FC-1#、FC-21#菌落数均增加，GLU消耗增加。说明FC-1#、FC-21#这两组粉尘能加速正常菌对GLU的分解利用，增加代谢酸性产物，促进正常菌生长代谢。

本研究通过SEM观察5种自然降尘与两种细菌相互作用后细菌形态学改变，结果也表明降尘颗粒的形状不规则性大大增加了其与细菌间的膜界结合程度，自然降尘颗粒越小，越容易与菌体结合。已有研究表明，很多细菌表面都黏附有PM2.5的自然降尘，自然降尘越细，相互黏附度就越高，相对表面积越大，界膜接触面就越充分，与细菌接触的机会就越多，接触程度越高。近尺寸作用就会越激烈。同时细菌喜欢寄居于粉尘颗粒不规则表面，降尘颗粒的形状不规则性大大增加了其与细菌间的膜界结合程度，如自然降尘表面凹处和自然降尘颗粒之间会填满大量细菌，表现各菌体团聚与黏附。

现阶段人们越来越重视环境超细颗粒物的健康效应，但大多注重其对呼吸系统的作用。本研究结果表明，Ca含量高的碱性自然降尘对大肠埃希菌、表皮葡萄球菌的生长有促进作用；自然降尘颗粒越小，越容易与菌体结合。但自然降尘与两种细菌作用过程中，如对矿物颗粒物的圆化、粉化、槽蚀等行为，以及由此引起的颗粒物表面形态、基团、活性、电荷等发生什么样的矿物学变化等问题[14～16]，还有待于进一步研究。

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Near size reciprocity between natural dustfalls and two normal bacteria of human body in vitro

LUXiu-lan1,DONGFa-qin,DENGJian-jun,DAIQun-wei,ZENGYa-li

(1SichuanMianyang404Hospital,Mianyang621000,China)

Objective To analyze the near size reciprocity of five kinds of natural dustfalls from different areas on human escherichia coli and staphylococcus epidermidis. Methods We chose five kinds of different natural dustfalls (FC-1#, FC-2#, FC-15#, FC-18#and FC-21#) to analyze their features, grain diameter, grain size parameter and major chemical constituents. In separate culture medium where each dustfall interacted with escherichia coli and staphylococcus epidermidis, we observed the changes of elements such as bacterial counts, pH value, GLU, Mn, Pb, Fe, Si and the transition of bacterial morphology. Results FC-1#contained more CaO; FC-2#, FC-15#, FC-18#, FC-21#contained more SiO2; and the LOI of FC-1#and FC-15#was higher than other dustfalls. The natural dust particle diameter was 0.3-1 μm. After five different natural dustfalls interacted with escherichia coli and staphylococcus, we compared it with that of each control group, bacterial colonies of FC-1#, FC-21#increased, GLU consume reduced and pH value increased (P<0.05 orP<0.01). After interacting with escherichia coli, we compared it with that of the control group, the dissolution of Fe, Ca, Ni, Si and Al in FC-1#increased, only the dissolution of Al increased in FC-2#, the dissolution of Fe and Ca increased in FC-15#, and the dissolution of Ca increased in FC-18#and FC-21#(P<0.05 orP<0.01). After interacting with staphylococcus epidermidis, we compared it with that of the control group, the dissolution of Ca, Mg, Ni, Si and Al increased in FC-1#, only the dissolution of Al increased in FC-2#, the dissolution of Fe, Ca increased in FC-15#, the dissolution of Ca, Mg increased in FC-18#, and the dissolution of Ca increased in FC-21#(allP<0.01). The result of bacterial morphology indicated that the irregular shape of dustfalls enhanced cohesion with bacterial membranes. Conclusions Alkaline natural dustfalls with high level of Ca can promote the growth of escherichia coli and staphylococcus epidermidis. The smaller the particle of natural dust falls is, the easier dustfalls cohere with bacteria.

natural dustfalls; escherichia coli; staphylococcus epidermidis; element

国家自然科学基金重点项目(41130746)；国家自然科学基金面上项目(41472046)。

卢秀兰(1973-)，女，主管技师，主要从事职业病及毒理学研究。E-mail: srt_latour@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.002

R122.26

A

1002-266X(2015)12-0005-05

2014-11-19)