BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物的制作及其在兔尺骨骨缺损修复中的应用

张彬，湛梅圣，赵玉玺，王万垠，杨建强，沈建强，刘运华，唐金兵，李彦国，吴璇

(枣阳市第一人民医院，湖北枣阳441200)

BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物的制作及其在兔尺骨骨缺损修复中的应用

张彬，湛梅圣，赵玉玺，王万垠，杨建强，沈建强，刘运华，唐金兵，李彦国，吴璇

(枣阳市第一人民医院，湖北枣阳441200)

目的 制作兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)-骨形态蛋白2(BMP2)-煅烧牛骨复合物，并观察其在兔尺骨骨缺损修复中的应用。方法 将兔BMSCs分离、培养及成骨诱导后，接种于BMP2-煅烧牛骨复合物，扫描电镜下观察复合情况。将54只新西兰大白兔随机分为观察组、对照组、空白组各18只，于无菌条件下造成右侧尺骨中段10 mm长缺损。观察组植入BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物，对照组植入BMP2-煅烧牛骨复合物，空白组不植入任何材料，术后均不做任何内外固定。各组术后4、8、12周每组随机处死6只，分别行骨缺损处的放射学和组织学检查。结果 成骨诱导后的BMSCs均匀分布在煅烧骨表面及孔洞内，与煅烧骨表面贴附紧密，细胞呈圆形，表面光滑，胞体较大，直径15 μm。随着术后时间的延长，观察组和对照组Lane-Sandhu放射学评分、组织学评分均逐渐升高，P均<0.05；空白组无变化，P均>0.05。术后4、8、12周，观察组和对照组Lane-Sandhu放射学评分、组织学评分均高于空白组，观察组升高更明显，P均<0.05。结论 BMSCs能够较好地与BMP2-煅烧牛骨复合物进行体外复合培养，BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物植入有助于兔尺骨骨缺损的修复。

骨髓间充质干细胞；骨形态蛋白2；煅烧牛骨；骨缺损；兔

治疗骨缺损最理想的材料是自体骨，但自体骨来源有限，取骨增加患者痛苦。骨组织工程学的提出为这一难题的解决提出了新思路，体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在特定的诱导条件下可定向分化为具有典型表型特征的成骨细胞[1]。诱导后的BMSCs可与合适的载体复合[2]，而煅烧牛松质骨具有良好的组织相容性和可靠的生物安全性，孔隙率高有利于成骨细胞的长大和分化，是一种理想的生物支架材料[3]。骨形态蛋白2(BMP2)能够极好地模拟天然骨基质促发及指导矿化功能，在局部形成偏酸环境，促进局部钙磷沉积、成核和生物自组装矿化[4,5]。2013年1月～2014年7月，我们制作了BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物，并用于修复兔尺骨骨缺损，取得了较好效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 4月龄新西兰大白兔64只(华中科技大学同济医学院动物实验中心),雌雄不限,体质量2.0～2.5 kg。DulbeccoMEM(DMEM)培养基(美国HyClone公司)，Percoll细胞分离液(美国Amshan-Pharmacia公司)，胎牛血清(FBS,美国Gibco公司)，四甲基噻唑蓝(MTT,美国Gibco公司)，麦胚凝集素(Sigma公司)。BMP2-煅烧牛骨复合物(华中科技大学同济医学院附属协和医院骨疾病研究所)，SW-CJ-LF净化工作台(苏州安泰公司)，细胞培养板(德国葛莱娜第一生化股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs的分离、培养和成骨诱导 取新西兰大白兔10只，采用全骨髓法离心分离兔股骨骨髓基质细胞。以3×106/mL接种至100 mL培养瓶，加入基础培养基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素)，置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度孵育箱内孵育。待细胞长满单层后，0.25%胰蛋白酶进行1∶4消化传代，接种密度为2×105/mL,继续用诱导培养基(含10×103mol/L的β-甘油磷酸钠、50 mg/L的L-抗坏血酸、1×10-8mol/L的地塞米松)培养。成骨诱导3周后行改良钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色和钙化结节茜素红染色，评估成骨诱导效果。ALP染色：取第3代细胞爬片,采用改良钙钴法ALP染色,甲基绿复染。钙化结节茜素红染色：取第3代细胞爬片,形成钙化结节后取出,95%乙醇固定后,0.1%茜素红-Tris-HCl漂染30 min。将已形成钙化结节的细胞爬片,加入100 mg/L四环素,培养30 min后,更换新鲜培养基,继续培养30 min，PBS液漂洗2次，95%乙醇固定，在反射荧光显微镜下观察。

1.2.2 BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物的制作 ddH2O冲洗BMP2-煅烧牛骨复合物,自然干燥后环氧乙烷灭菌，置于6孔培养板中。加入DMEM培养液浸泡过夜,吸出DMEM培养液备用。取成骨诱导3周后兔BMSCs,经消化、离心、重悬后，用成骨诱导培养基计数细胞浓度为1×105/mL,直接接种到备用的BMP2-煅烧牛骨复合物上,置于37 ℃、5% CO2条件下培养2 h。将复合物翻面再次接种细胞,每次接种尽量使细胞充分渗进BMP2-煅烧牛骨复合物中，光镜下观察复合情况。

1.2.3 BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物的应用

1.2.3.1 造模与分组处理 将54只新西兰大白兔随机分为观察组、对照组、空白组各18只，参照郑启新、段智霞等[3,5]的方法，于无菌条件下造成右侧尺骨中段10 mm长缺损。造模完成后，观察组立即植入BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物，对照组植入BMP2-煅烧牛骨复合物，空白组不植入任何材料，术后均不做任何内外固定。

1.2.3.2 骨缺损修复情况观察 各组术后4、8、12周随机处死6只新西兰兔，分别进行放射学和组织学检查。放射学检查：对兔骨缺损修复肢行X线摄片，观察其骨缺损修复情况，并进行Lane-Sandhu放射学评分。组织学检查：放射学检查完成后，在麻醉状态下处死动物，立即以尺骨骨缺损部位为中心取约3 cm不含软组织的完整尺骨，4%甲醛固定24 h，依次进行脱钙、脱水、石蜡包埋切片及HE染色处理，光镜下观察，并进行Lane-Sandhu组织学评分。

2 结果

2.1 BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物的制作效果

2.1.1 细胞成骨能力 光镜下ALP染色的细胞胞质内见大量黑色或褐色颗粒沉淀(见插页Ⅰ图1A),钙化结节茜素红染色显示较多深红色钙化结节(见插页Ⅰ图1B)；反射荧光显微镜下四环素荧光染色,见钙化结节呈强烈的金黄色荧光改变(见插页Ⅰ图1C) 。

2.1.2 细胞复合情况 成骨诱导后的BMSCs均匀分布在煅烧骨表面及孔洞内,与煅烧骨表面贴附紧密,细胞呈圆形,表面光滑,胞体较大,直径15 μm。

2.2 BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物修复骨缺损效果

2.2.1 放射学检查结果 观察组术后4周，骨缺损处有新生骨，缺损界面模糊缩小，可见均匀的骨痂影，出现不规则密度降低区；术后8周，缺损区界线模糊，有较多密度增高的骨痂阴影，与骨断端融合界限不清，移植骨部分吸收，与骨缺损区连接模糊明显缩小；术后12周，新骨充满整个缺损区，高密度的阻射影均匀一致，骨断端与缺损区融合，髓腔再通，已接近正常骨组织。对照组术后4周，骨缺损处有少量骨痴形成，骨界线模糊，相对变化不明显；术后8周，缺损处有所缩小，与4周时比较，变化不明显；术后12周，缺损处有大量新骨形成，缺损处明显填充，但未完全愈合。空白组术后4、8、12周均无明显变化，骨缺损区仍然存在。各组术后4、8、12周Lane-Sandhu放射学评分比较，见表1。

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05；与同组术后4周比较，△P<0.05；与同组术后8周比较，○P<0.05。

2.2.2 组织学检查结果 观察组术后4周，移植复合物内开始有新生微血管生成，内部孔隙可见类基质沉积,含胞质丰富的成骨细胞；术后8周，可见骨小梁增粗、变大,新生成骨细胞增生活跃,编织骨基本改建为板层骨,可见哈弗管结构；术后12周，移植区域出现大量成熟骨结构,骨皮质连续,缺损区域骨结构与正常骨结构大致相同, 破骨细胞增生活跃，髓腔通畅。对照组术后4周，可见骨小梁不整齐伴骨基质生成,其边缘的成骨细胞多呈单层增生；术后8周，可见大量的骨小梁排列不规则,少量板层骨形成,成骨细胞增生活跃,类骨组织转为编织骨；术后12周，可见大量条索状板层骨形成伴编织骨,骨细胞排列整齐,骨小梁较前期粗大。空白组术后4周，可见活跃的成纤维细胞,炎症细胞浸润伴结缔组织增生,散在的骨小梁生成；术后8周，可见明显的炎性反应,骨小梁生成较前成熟,其周围大量活跃的成纤维细胞；术后12周，可见纤维结缔组织充填缺损区,没有成骨表现。各组术后4、8、12周Lane-Sandhu组织学评分比较，见表2。

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05；与同组术后4周比较，△P<0.05；与同组术后8周比较，○P<0.05。

3 讨论

目前的研究认为,骨缺损修复的基本条件主要包括适宜的种子细胞、支架材料及可用的细胞因子[6]。适宜的种子细胞是人工植骨材料进行修复的基础， BMSCs作为骨组织工程中首选的种子细胞,具有取材方便、增殖能力和成骨能力强、免疫原性弱等优点[7]。BMSCs在体外、体内均有向多种间质细胞谱系分化的能力，因此在目前骨组织工程中应用非常普遍[8]。BMSCs在成人骨髓中占有核细胞的0.000 1%～0.01%，所以需要经体外培养分离扩增，才能满足需要[9，10]。本研究从兔股骨中分离出BMSCs,经过分离、培养、纯化及体外诱导，对诱导分化后的成骨细胞进行改良钙钴法ALP染色和钙化结节茜素红染色鉴定成骨的性能,初步建立了体外大量获取成骨能力肯定的骨组织工程种子细胞的一种有效方法,为后期骨缺损的再生性修复提供前期研究基础。

BMPs广泛存在于动物骨豁、牙齿中，是一类能够提供间充质细胞向成骨细胞分化的始发信号的低分子糖蛋白,主要是诱导未分化的间充质细胞和成骨细胞的前体细胞向成骨细胞发展[11，12],其中BMP2的诱导成骨作用是BMPs家族中最强的[13，14]。煅烧骨是一种以羟基磷灰石为主要成分的生物材料，通过煅烧可将骨中的全部有机物氧化清除，彻底消除异种抗原，同时还能保留动物骨原有的无机盐骨架并形成高度多孔结构，以适合成骨细胞移行并快速修复骨缺损。郑启新等[3]研究表明, 煅烧牛松质骨具有一定的强度,孔径合适, 微孔互相连通, 有可靠的生物安全性, 可作为植骨材料。临床研究表明，煅烧骨作为支架材料复合锌离子在动物骨缺损修复中取得了满意疗效[15]。

本研究将BMSCs和BMP2-煅烧牛骨复合物进行体外复合培养，能够更好地弥补单一元素应用受到的限制，发挥种子细胞、细胞因子、支架材料的协同作用，更好地适合微血管、肉芽纤维组织的长入，以及骨与软骨组织的分化形成，并可促进支架材料的吸收降解。本研究结果表明，随着术后时间的延长，观察组和对照组Lane-Sandhu放射学评分、组织学评分均逐渐升高(P均<0.05)；术后4、8、12周，观察组和对照组Lane-Sandhu放射学评分、组织学评分均高于空白组，观察组升高更明显(P均<0.05)。放射学和组织学检查表明，术后12周，观察组骨断端与缺损区融合，髓腔再通，已接近正常骨组织；而对照组未完全愈合，空白组没有成骨表现，骨缺损区仍然存在。本研究初步证实了BMSCs-BMP2-煅烧牛骨复合物具有良好的骨缺损修复效果，为临床应用提供了理论基础和实验依据，为骨修复材料的研制提供了新的思路。

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Fabrication of BMSCs/BMP-2/calcined bone complex and its application in the repair of bone defect of rabbit ulna

ZHANGBin,ZHANMei-sheng,ZHAOYu-xi,WANGWan-yin,YANGJian-qiang,SHENJian-qiang,LIUYun-hua,TANGJin-bing,LIYan-guo,WUXuan

(TheFirstPeople'sHospitalofZaoyang,Zaoyang441200,China)

Objective To make the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)/bone morphogenetic protein 2 (BMP2)/calcined bone complex, and to observe its application in the repair of bone defect of rabbit ulna. Methods After the isolation, culture and osteogenic induction of rabbit BMSCs, we inoculated on BMP2/calcined bone complex, and observed the compound situation under scanning electron microscope. Fifty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into the experimental group, control group, and blank group with 18 rats in each group. Under the sterile conditions, 10 mm defect of the right middle ulna was made. The experimental group was implanted BMSCs/BMP2/calcined bone complexes, while the control group was implanted BMP2/calcined bone complexes, and the blank group without any implantation. After the operation, we did not make any internal and external fixation. After operation 4, 8, and 12 weeks, 6 rabbits in each group were randomly sacrificed, and the radiological and histological examinations of the bone defects were conducted. Results The BMSCs cells after the osteogenic induction uniformly distributed in the bone surface and hole, and calcined bone surface attached closely, cells were round with smooth surface, large cell body and the diameter of 15 μm. With the extension of time, the Lane-Sandhu radiological score and histological score of the experimental group and the control group were increased gradually (allP<0.05); the blank group had no change (P>0.05). Four, eight and twelve weeks after implantation, the Lane-Sandhu radiological score and histological score of the experimental group and the control group were higher than those of the control group, and the experimental group increased more significantly (allP<0.05). Conclusion BMSCs can co-culture with BMP2/calcined bone complexes better in vitro, and the implantation of BMSCs/BMP2/calcined bone complexes help the repair of rabbit ulna bone defect.

bone marrow mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein 2; calcined bone; bone defect; rabbits

湖北省卫生厅科研指导性项目 (JX6C-44)。

张彬(1970-)，男，副主任医师，研究方向为骨科基础与临床。E-mail: 13972058889@139.com

赵玉玺(1984-)，男，主治医师，研究方向为骨与关节损伤。E-mail: zyx8023wx@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.005

R318.08

A

1002-266X(2015)12-0017-04

2014-08-03)