子痫前期患者胎盘及脐带组织IDO、MIF表达变化及意义

张静，杨再全，李霞，姚晓玲，田园，于彩霞

(1沧州医学高等专科学校，河北沧州061001；2沧州市传染病医院；3沧州市人民医院)

子痫前期患者胎盘及脐带组织IDO、MIF表达变化及意义

张静1，杨再全2，李霞3，姚晓玲3，田园1，于彩霞1

(1沧州医学高等专科学校，河北沧州061001；2沧州市传染病医院；3沧州市人民医院)

目的 观察子痫前期(PE)患者胎盘及脐带组织吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达变化，并探讨其意义。方法 PE患者66例，其中轻度32例(轻度组)、重度34例(重度组)，同期健康晚孕妇女42例作为对照组。分别采用RT-PCR法和Western blot法检测胎盘、脐带组织中IDO、MIF mRNA和蛋白，用彩色超声多普勒诊断仪检测各组产前胎儿的脐动脉血流阻力指数(RI)，记录新生儿体质量。结果 重度组、轻度组、对照组胎盘、脐带组织IDO mRNA及蛋白相对表达均逐渐升高，MIF mRNA及蛋白相对表达、RI均逐渐降低；组间两两比较，P均<0.01。重度组新生儿体质量均低于轻度组和对照组，P均<0.01。PE患者中，胎盘、脐带组织IDO、MIF mRNA相对表达均呈负相关(r分别为-0.468、-0.455)，P均<0.01；胎盘、脐带组织IDO mRNA表达水平与RI均呈负相关(r分别为-0.317、-0.526)，与新生儿体质量均呈正相关(r分别为0.398、0.461)，P均<0.01；胎盘、脐带组织MIF mRNA表达水平与RI均呈正相关(r分别为0.393、0.502)，与新生儿体质量均呈负相关(r分别为-0.302、-0.431)，P均<0.01。结论 PE患者胎盘及脐带组织中IDO表达降低、MIF表达升高，与胎儿RI升高和新生儿体质量降低有关，可能参与PE的发病。

子痫前期；吲哚胺2，3-双加氧酶；巨噬细胞移动抑制因子；炎症因子；妊娠

子痫前期(PE)是妊娠特发性疾病，长期以来因其发病机制不明且缺乏有效治疗方法而成为产科领域的一大困扰[1]。其特征性病理改变是血管内皮细胞损伤及功能障碍，而过度炎症刺激及氧化应激是导致血管内皮细胞损伤的直接原因。吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)是机体重要的内源性保护体系，其在母胎界面的适度表达是妊娠维持的保障[2]。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)作为一种与炎症密切相关的前驱因子，在PE的发病过程中发挥重要调节作用[3]。本研究观察正常晚孕妇女及PE患者胎盘、脐带组织中IDO、MIF的表达变化，并探讨其意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年4月～2013年8月于沧州市人民医院产科住院分娩的PE患者66例，其中轻度32例(轻度组)、重度34例(重度组)，PE诊断标准及分类依据参照第8版《妇产科学》。选择同期健康晚孕妇女42例作为对照组，3组均为首次妊娠、单胎，均除外其他内外科并发症，无烟酒等不良嗜好，均以腰麻下剖宫产术结束分娩。轻度组年龄(26.8±4.4)岁、孕(37.9±0.6)周，重度组分别为(27.1±3.7)岁、(37.3±1.7)周，对照组分别为(26.0±3.5)岁、(38.0±0.5)周。各组年龄、孕周均具有可比性(P均>0.05)。

1.2 材料 兔抗人IDO多克隆抗体及兔抗人MIF多克隆抗体(美国分子标记公司)，山羊抗兔IgG(中杉金桥)，总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷)，RT-PCR试剂盒(上海生工)，TC-XP-G基因扩增仪(杭州博日)，GIS 1D(Ver.4.0)图像分析软件(上海天能)。

1.3 方法

1.3.1 标本处理方法 胎盘娩出后20 min内，无菌状态下取胎盘和脐带组织各约1 g，冰上生理盐水漂洗后分别置于1.5 mL无菌离心管中，液氮罐转运至-70 ℃冰箱保存。

1.3.2 胎盘和脐带组织IDO、MIF mRNA检测 采用RT-PCR法。提取胎盘及脐带组织总RNA，严格参照试剂盒说明书操作。基因序列从GenBank获得，Primer Premier5.0软件设计引物序列，上海生工合成。IDO上游引物：5′-TTTGCTAAAGGCGCTGTTGG-3′，下游引物5′-CCTTCATACACCAGACCGTCTGA-3′，扩增长度168 bp；MIF上游引物：5′-GCCCGGACAGGGTCTACA-3′，下游引物：5′-CTTAGGCGAA-GGTGGAGTTGTT-3′，扩增长度125 bp；以GADPH为内参，上游引物：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，扩增长度146 bp。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 5 min。取5 μL反应产物，15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，结果用计算机扫描分析，IDO、MIF mRNA相对表达以目的基因与内参基因扩增条带的实际灰度值的比值表示。

1.3.3 胎盘和脐带组织IDO、MIF蛋白检测 采用Western blot法。取-70 ℃保存的各组胎盘和脐带组织样品适量，液氮下研磨后移入预冷的匀浆管；加入等比例组织裂解液，冰浴中匀浆；将匀浆液转移至1.5 mL离心管中，4 ℃ 10 000 r/min离心约10 min；小心吸取上清液，分装保存至新离心管中即为蛋白样本，采用蛋白浓度测定试剂盒分别检测各样本中总蛋白浓度。以Action作为内参，进行电泳、转膜，牛奶封闭、过夜。加入一抗、二抗，显影，曝光，计算机扫描及分析系统检测各条带平均灰度值(A)，目的蛋白的相对表达量以目的条带与内参的A值比表示。

1.3.4 其他观察指标 各组均于产前2 d采用飞利浦iU Elite全身彩色超声多普勒诊断仪(探头频率5.0 MHz)测定胎儿脐动脉血流阻力指数(RI)。记录新生儿的体质量。

2 结果

2.1 各组胎盘、脐带组织IDO、MIF mRNA相对表达量比较 见表1。

2.2 各组胎盘、脐带组织IDO、MIF蛋白相对表达量比较 见表2。

2.3 各组RI及新生儿体质量比较 见表3。

2.4 各指标相关性分析结果 PE患者中，胎盘、脐带组织IDO、MIF mRNA相对表达均呈负相关(r分别为-0.468、-0.455)，P均<0.01；胎盘、脐带组织IDO mRNA表达水平与RI均呈负相关(r分别为-0.317、-0.526)，与新生儿体质量均呈正相关(r分别为0.398、0.461)，P均<0.01；胎盘及脐带组织MIF mRNA表达水平与RI均呈正相关(r分别为0.393、0.502)，与新生儿体质量均呈负相关(r分别为-0.302、-0.431)，P均<0.01。

注：与对照组同一组织比较，*P<0.01；与轻度组同一组织比较，#P<0.01。

注：与对照组同一组织比较，*P<0.01；与轻度组同一组织比较，#P<0.01。

注：与对照组比较，*P<0.01；与轻度组比较，#P<0.01。

3 讨论

PE是妊娠期特有疾病，其特征性病理改变为血管内皮细胞损伤和功能障碍，而过度炎症刺激和氧化应激是导致内皮细胞损伤的直接原因，但刺激因子的来源及其调控机制至今未明。研究发现，PE患者血清可损伤体外培养的人脐静脉内皮细胞[4]，而产后这一作用迅速消失。因此，多数学者认为其损伤来源是一种急性短期应激反应，考虑与胎盘有关。

IDO是一种含亚铁血红素的单体蛋白，相对分子量42 kD，是肝脏以外催化Trp沿犬尿酸途径分解代谢的惟一限速酶。其主要由外周血单核/巨噬细胞和胎盘滋养细胞分泌，参与机体抗炎、抗感染及抗氧自由基等多种病理生理过程。正常情况下，体内IDO呈低水平表达；在受到致炎因子及氧化应激刺激时，IDO的表达升高，消耗局部微环境中的Trp及氧自由基，发挥清除氧自由基、抗炎及减轻炎症损伤的作用[5]，是人体重要的内源性保护体系之一。器官移植领域的大量研究证实，IDO可通过促使局部环境中Trp减少和犬尿酸增多来抑制T细胞增殖、促进T细胞凋亡，参与并诱导同种异体移植免疫耐受、降低排斥反应[6]。有关流产的多项研究也表明，正常的IDO表达及活性是妊娠得以维持的必要保障，其在母胎界面的表达减少是导致胎儿流失的高危因素[7]。而PE具有与流产相类似的免疫机制，且使用IDO抑制剂后，正常妊娠小鼠出现了类似PE的表现[8]。因此推测，IDO在母胎界面的表达变化与PE的发病有关，但其在母胎界面的精确定位报道不一，调节机制仍未明确。近年来有关PE发病机制的研究表明，系统性的炎症反应是PE发病的中心环节[9]。MIF作为炎症反应的前驱因子，主要由单核/巨噬细胞及活化的T细胞分泌，并储备于胞质中。当机体受到应激刺激时，MIF可迅速分泌出胞，吸引巨噬细胞向炎症部位移动、聚集，并抑制其游走，增强巨噬细胞的吞噬功能。同时MIF可诱导巨噬细胞分泌多种致炎因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等[10]。已知IFN-γ是最主要的IDO激活物[11]，TNF-α、脂多糖(LPS)及IL-1等致炎因子可增强IFN-γ对IDO的激活作用。因此推测，IDO及MIF的表达变化可能在PE的发病过程中发挥重要作用。

在前期的研究中发现，IDO蛋白表达定位于胎盘滋养细胞、血管内皮细胞及脐血管平滑肌细胞胞质中，间质也有少量表达，MIF蛋白与其具有共定位现象。本研究结果显示，PE患者IDO mRNA及蛋白表达降低，且随PE病情加重而降低，MIF则与之相反，二者呈负相关。推测可能由于正常妊娠为轻度炎症反应， MIF分泌较少，聚集巨噬细胞及上调炎症因子的表达有限，因而促进IFN-γ对IDO的激活作用诱导IDO表达升高，消耗局部微环境中Trp及氧自由基，发挥局部抗炎及抗氧化等保护作用维持妊娠；而PE由于存在过度炎症反应[9]，刺激大量储备型MIF迅速分泌出胞，体内致炎因子及氧自由基短时间内迅速增加，导致局部IDO过度消耗，局部免疫保护缺失，血管内皮细胞损伤加重，最终导致PE的发生。但这一推测仍待进一步的验证。前期的研究结果显示，脐血管中膜平滑肌细胞MIF蛋白表达随PE病情的加重而升高，推测与MIF上调前列腺素E2合成及缩血管作用加强有关[12]。

本研究同时发现，PE患者伴随低体质量儿出生，临床监测RI升高；且PE患者IDO mRNA及蛋白表达与RI均呈负相关、与新生儿体质量均呈正相关，而MIF则与之相反。说明RI可作为临床监测胎儿发育情况、评判PE病情严重程度的敏感指标，且操作较简便。因此，PE患者胎盘及脐带组织中IDO表达降低、MIF表达升高，与胎儿RI升高和新生儿体质量降低有关，可能参与PE的发病，临床上要加强对胎儿RI的监测。今后的研究将进一步深入探讨IDO及MIF的调控机制，有助于明确PE的发病机理、研究防治措施，以及开发以IDO及MIF为靶点[13]的有效治疗药物等。

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河北省高等学校科学技术研究青年基金资助项目(QN20132002)。

张静，E-mail: 18031793397@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.024

R714.244

B

1002-266X(2015)12-0061-03

2014-10-17)