猴头多糖对小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用及机制探讨

姜颖，于英君，刘国良，齐彦，李红影，孙力( 黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨50040;黑龙江中医药大学佳木斯学院)

猴头多糖对小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用及机制探讨

姜颖1，于英君1，刘国良2，齐彦1，李红影1，孙力1
( 1黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨150040;2黑龙江中医药大学佳木斯学院)

摘要:目的观察猴头多糖对小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用，并从细胞凋亡角度探讨其作用机制。方法将50只小鼠腋下皮下注射S180肉瘤细胞，制作肿瘤移植模型。造模成功后随机分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型组、环磷酰胺组各10只，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别予猴头多糖25、50、100 mg/kg灌胃，1次/d，共干预10 d;模型组予生理盐水0.2 mL/d灌胃，连续10 d;环磷酰胺组予环磷酰胺40 mg/kg腹腔注射，1次/d，共干预5 d。于第10天处死各组小鼠，计算抑瘤率，TUNEL法检测凋亡细胞，免疫组化法检测Caspase-3蛋白。结果低剂量组、中剂量组、高剂量组、环磷酰胺组抑瘤率分别为36.36%、57.57%、43.93%、74.24%，环磷酰胺组抑瘤率明显高于其余各组，中剂量组抑瘤率高于低剂量组、高剂量组，P均＜0.05;凋亡细胞数及Caspase-3蛋白表达为环磷酰胺组＞中剂量组＞高剂量组＞低剂量组＞模型组，P均＜0.05。结论猴头多糖可抑制小鼠皮下移植肉瘤的生长，以50 mg/kg剂量作用最佳;该作用与其增加Caspase-3蛋白表达、促进肿瘤细胞凋亡有关。

关键词:猴头多糖;肉瘤;细胞凋亡;凋亡相关蛋白

Inhibitory effect of Hericium erinaceus polysaccharide on mice subcutaneous transplanted sarcoma and its mechanism

JIANG Ying1，YU Ying-jun，LIU Guo-liang，QI Yan，LI Hong-ying，SUN Li
( 1 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Abstract:Objective To observe the inhibitory effect of Hericium erinaceus polysaccharide on the mice subcutaneous transplanted sarcoma，and to explore its mechanism from apoptosis perspective.Methods S180 sarcoma cells were subcutaneously injected into 50 mice to produce the models of subcutaneous tumor transplantation.After successful modeling，the tumor bearing mice were randomly divided into five groups，10 in each group: the low-dose group，medium-dose group，high-dose group，model group and cyclophosphamide group.The low-dose，medium-dose and high-dose groups were given hedgehog polysaccharide 25，50 and 100 mg/kg，orally，once a day，and for 10 days.The model group was given normal saline 0.2 mL/day orally and for 10 days.Cyclophosphamide was administered with 40mg/kg by intraperitoneal injection once a day for 5 days.All the mice were killed after 10 days of treatment.We calculated the inhibition rate of each group.The apoptosis in each group was detected by TUNEL assay.Caspase-3 protein was detected by immunohistochemical method.Results The tumor inhibition rates in the low-dose group，medium-dose group，high-dose group and cyclophosphamide group were 36.36%，57.57%，43.93% and 74.24%.The tumor inhibition rate in the cyclophosphamide group was higher than those in the other groups，and in the medium-dose group，the tumor inhibition rate was higher than those of the low-dose group and high-dose group ( all P＜0.05).The number of apoptotic cells and Caspase-3 protein expression were as follows: cyclophosphamide group＞medium-dose group＞high-dose group＞low-dose group＞model group ( all P＜0.05).Conclusion Hericium erinaceus polysaccharide can inhibit the growth of xenograft sarcoma，and the dose of 50 mg/kg dose is the best.This mechanism may be related to its up-regulation of Caspase-3 protein expression and thereby promoting tumor cell apoptosis.

Key words:Hericium erinaceus polysaccharide; sarcoma; apoptosis; apoptosis-related protein

肉瘤是指来源于间叶组织的恶性肿瘤，多发生于皮肤、皮下、骨膜及长骨两端。目前临床常采用手术切除肉瘤再行放、化疗的联合治疗方法，但疗效较差，不良反应多，且易产生抗药性［1］。因此，寻找高效、低毒的治疗药物是目前的研究热点。猴头多糖是猴头菌的主要生物活性成分，能提高人体免疫力，抑制肿瘤细胞的增殖［2，3］。目前，猴头多糖治疗肉瘤效果及其作用机制尚不明确。2014年1～10月，我们观察了猴头多糖对小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用，从细胞凋亡角度探讨其作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料健康6～8周龄昆明小鼠50只，雌雄各半，体质量( 20±2) g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，饲养、手术、给药及取材等环节均严格遵守实验动物科学与管理的有关规定;小鼠S180肉瘤细胞株购自中国科学院细胞库;猴头多糖由黑龙江中医药大学生物化学与分子生物学实验室制备;免疫组化检测试剂盒、兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司; TUNEL试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司(批号13110925)。

1.2实验方法

1.2.1皮下移植瘤模型制备与分组将S180肉瘤细胞( 5×105/mL，每只0.2 mL，腹腔注射)接种于昆明小鼠腹腔培养，在SPF环境饲养下小鼠状态良好; 7～10 d后抽取腹水，计数细胞后用生理盐水调整细胞密度至2×107/mL，在小鼠腋下皮下注射S180肉瘤细胞0.2 mL/只。50只接种小鼠在接种后当天随机分成模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、环磷酰胺组，每组10只。

1.2.2药物干预接种6 h后，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别予猴头多糖25、50、100 mg/kg灌胃，1次/d，共干预10 d;环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，1次/d，共干预5 d;模型组予生理盐水0.2 mL/d灌胃，共干预10 d。

1.2.3抑瘤作用观察干预后称量各组小鼠体质量，颈部脱臼法处死;完整剥离右前腋下肿瘤组织，冰冷生理盐水清洗后、滤纸吸干。取模型组之外的各组肿瘤组织，称重，计算各组抑瘤率。抑瘤率=(模型组平均瘤重－实验组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。

1.2.4细胞凋亡观察采用TUNEL法。将肿瘤组织石蜡切片后，PBS漂洗，蛋白酶K室温孵育;加入转化剂PDB，在湿盒中孵育; DAB底物溶液显色，苏木精复染，封固，40倍镜下观察。凋亡细胞呈棕黄色，胞体缩小，核固缩。每张切片选取10个表达最强的视野，计数凋亡细胞。

1.2.5肉瘤组织Caspase-3蛋白表达检测将肿瘤组织固定，包埋、切片。采用免疫组化法检测，按试剂盒说明操作。阳性细胞定位于细胞质和细胞核，呈棕黄色。按阳性细胞百分率计分:无阳性细胞为0分; 1%～25%为1分; 25%～50%为2分; 50%～75%为3分; 75%～100%为4分。按染色强度评分:无色为0分;弱阳性为1分;中等强度为2分;强阳性为3分。两者得分相加为最后评分，以得分平均值表示Caspase-3蛋白表达量［4］。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间均数比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组抑瘤率比较低剂量组、中剂量组、高剂量组、环磷酰胺组抑瘤率分别为36.36%、57.57%、43.93%、74.24%。环磷酰胺组抑瘤率明显高于其余各组，中剂量组抑瘤率明显高于低剂量组、高剂量组( P均＜0.05)。

2.2各组凋亡细胞比较低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型组、环磷酰胺组凋亡细胞分别为( 4.600±0.516)、( 10.100±0.875)、( 8.900± 1.398)、( 2.300±0.949)、( 13.600±0.516)个，细胞凋亡数为环磷酰胺组＞中剂量组＞高剂量组＞低剂量组＞模型组( P均＜0.05)。

2.3各组肉瘤组织Caspase-3蛋白表达比较低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型组、环磷酰胺组的Caspase-3蛋白表达水平分别为( 3.100±0.737)、( 6.600±0.516)、( 4.700±0.948)、( 2.400± 0.699)、( 6.700±0.483)分，Caspase-3蛋白表达水平为环磷酰胺组＞中剂量组＞高剂量组＞低剂量组＞模型组( P均＜0.05)。

3　讨论

肉瘤是一种少见且恶性程度高的肿瘤，根据发生部位可分为骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤等，预后多不理想。其预后主要取决于治疗时机，以及手术是否彻底、有无转移、患者对放化疗的敏感程度等［5～7］。环磷酰胺是临床应用多年的抗肿瘤药物，因其抑瘤作用稳定，常被作为阳性对照药物。

细胞凋亡是一种生理性细胞程序性死亡，发生机制复杂，受多种因素的影响。近年来，通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗肿瘤的研究成为热点。Caspase-3蛋白属于半胱氨酸蛋白酶家族成员中执行细胞凋亡的

主要蛋白之一，在细胞凋亡过程中发挥重要的功能。有研究表明，Caspase-3能够破坏细胞的修复作用，引起细胞周期的阻滞［8］;并且，Caspase-3能够通过降解凋亡抑制蛋白( Bcl-2)而被Caspase家族上游起始蛋白激活，从而形成级联反应，促进细胞凋亡［9～12］。

研究发现，中药多糖具有抑制肿瘤细胞增殖、调节生物应答、诱导分化、抑制肿瘤血管系统、逆转耐药性、促进细胞凋亡、影响蛋白表达等作用［13］。猴头多糖是从优质猴头菇子实体中提取的有效活性成分。《中国药用真菌》记载，猴头菌性平，味甘，能利五脏，助消化，滋补，抗癌，治疗神经衰弱等。近年研究发现，猴头多糖是其最重要的活性物质之一，具有调节免疫功能、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗炎、抗突变、抗辐射等功能。现代医学认为，其对机体免疫功能的调节是抗肿瘤的重要机制之一。研究发现，猴头多糖能提高荷瘤小鼠的免疫指数，下调荷瘤鼠肿瘤细胞Bcl-2的表达水平，上调Bax的表达。表明其可通过提高小鼠的免疫功能来达到抗肿瘤的作用。本研究发现，中剂量组抑瘤率最高，提示猴头多糖中剂量能够有效抑制小鼠S180肉瘤生长，抑瘤作用较好，但低于环磷酰胺组。中剂量组凋亡细胞数最多，低剂量组凋亡细胞最少。低、中、高剂量组Caspase-3均高表达，以中剂量组最高。提示猴头多糖可抑制肿瘤增长，可能与调节Caspase-3活性介导小鼠S180细胞凋亡有关。

综上所述，猴头多糖可抑制小鼠皮下移植肉瘤的生长，以50 mg/kg剂量作用最佳;该作用与其增加Caspase-3蛋白表达、促进肿瘤细胞凋亡有关。

参考文献:

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［13］李玉芳.中药多糖抗肿瘤机制研究进展［J］.实用癌症杂志，2007，22( 5) : 546-550.

收稿日期:( 2015-05-25)

通信作者简介:孙力( 1962-)，女，硕士，教授，研究方向为中药抗肿瘤的分子生物学机制。E-mail: sunli0129@ hotmail.com

作者简介:第一姜颖( 1981-)，女，博士，讲师，研究方向为中药抗肿瘤的分子生物学机制。E-mail: jiangying1222@163.com

基金项目:黑龙江省自然科学基金资助项目( 201329) ;黑龙江中医药大学校基金资助项目( 201409)。

文章编号:1002-266X( 2015)30-0008-03

文献标志码:A

中图分类号:R73-354

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.003