肺癌细胞株A549、H1650、DMS53中整合素α3的表达比较

张帆，唐妮娜，刘慧琳，郭琳琅(南方医科大学珠江医院，广州510282)

肺癌细胞株A549、H1650、DMS53中整合素α3的表达比较

张帆，唐妮娜，刘慧琳，郭琳琅
(南方医科大学珠江医院，广州510282)

摘要:目的比较整合素α3( ITGA3)在三种肺癌细胞株A549(肺腺癌)、H1650(肺泡细胞癌)、DMS53(小细胞肺癌)中的表达。方法应用基因芯片技术提取A549、H1650、DMS53细胞株的mRNA，反转录为cDNA，以32P标记cDNA，与整合素基因芯片进行杂交，经放射自显影后读取灰度值，并以基因表达的限制性分析( RAGE)和流式细胞仪技术进行验证。结果ITGA3亚单位在A549、H1650、DMS53细胞株中的表达分别为7.58±1.37、8.10± 1.51、2.38±0.20，A549、H1650与DMS53细胞株比较，P均＜0.01。RAGE结果显示，经AvaⅡ酶切后，A549、H1650、DMS53细胞株均出现ITGA3( 69 bp)，分别为167.0、172.1、44.7，A549、H1650与DMS53细胞株比较，P均＜0.01。流式细胞仪检测结果显示，ITGA3在A549、H1650、DMS53细胞株中的表达分别为83.62±1.40、90.86± 4.78、1.24±0.53，A549、H1650与DMS53细胞株比较，P均＜0.01。结论ITGA3在A549和H1650细胞株中的表达上调，高于其在DMS53细胞株中的表达。

关键词:肺肿瘤;肺癌细胞;整合素α3

肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一。随着工业化的发展及空气和环境污染的加剧，肺癌发病率逐渐增加，世界卫生组织估计，肺癌在全球的增长速度为每年0.5%，初治病例约70%是晚期患者［1］。肺癌的恶性程度与肿瘤的类型、级别相关。瘤细胞转移的早晚是肿瘤恶性程度的标志，而肿瘤的转移是一个极其复杂的过程，参与肿瘤转移调控的相关基因多达数百种。DNA修复基因、抑癌基因、抗凋亡基因、整合素等的多态性与个体对肺癌细胞的易感性有关［2～5］，其中整合素在调控肿瘤转移过程中起重要作用。随着肿瘤分子生物学研究技术的发展，越来越多的调控肿瘤转移和凋亡分子被发现，其中整合素在肺癌发生、发展、转移及凋亡各个步骤中所起的作用逐渐被认识。本研究应用基因芯片技术、基因表达的限制性分析( RAGE)和流式细胞仪检测并比较了三种不同类型的肺癌细胞株中整合素α3 ( ITGA3)的表达差异。

1　材料与方法

1.1细胞及试剂本实验所用A549(肺腺癌)、H1650(肺泡细胞癌)、DMS53(小细胞肺癌)细胞株购自The American Type Culture Collection( ATCC) ;所用基因芯片为细胞外基质和黏附分子分类芯片( SuperArray Inc.Bethesda，MD，USA) ;鼠抗人α3单克隆抗体购自美国Chemicon公司; FITC标记羊抗鼠IgG购自美国One Lambda公司; HexaLabelTMDNA Labeling Kit购自上海前尘生物科技有限公司。

1.2三种肺癌细胞株中ITGA3检测方法取冻存的A549、H1650、DMS53细胞株37℃融化后，1 000 r/min离心10 min，用含有10%胎牛血清( Hyclone公司)的低糖DMEM培养液(美国Invitrogen公司)悬浮，移入培养瓶中。培养液中加入青链双抗液，使终浓度为100 μg/mL，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，3 d换液1次。提取三种细胞株中的总RNA，浓缩、纯化，逆转录合成并以32P ( 10 Ci/L)标记cDNA，与基因芯片进行杂交，经放射自显影，可出现强弱不同的杂交点，以成像系统读取数值，并以软件ScanAlyze2和GEArrayAnalyzer分析。从基因库获取ITGA3亚单位的cDNA序列，采用MacVector公司ClustalW软件设计引物序列，进行PCR扩增，然后将ITGA3亚单位的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用分子图像FX成像器扫描凝胶，并用Bio-Rad软件分析。将1×106的培养细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次，50 mg/mL多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤破膜裂解细胞，用2 μg/mL的鼠抗人α3单克隆抗体孵育1 h，

800 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗2遍后，加入FITC标记羊抗鼠IgG抗体，稀释浓度为1∶50，孵育30 min。用流式细胞仪分析细胞的荧光水平。重复以上操作3次，取平均值。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用one-way ANOVA，两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

ITGA3亚单位在A549、H1650、DMS53细胞株中的表达分别为7.58±1.37、8.10±1.51、2.38± 0.20，A549、H1650与DMS53细胞株比较，P均＜0.01，A549与H1650细胞株比较无统计学差异。

RAGE结果显示，经AvaⅡ酶切后，A549、H1650、DMS53细胞株均出现ITGA3( 69 bp)，分别为167.0、172.1、44.7，A549、H1650与DMS53细胞株比较，P均＜0.01，A549与H1650细胞株比较无统计学差异。流式细胞仪检测结果显示，ITGA3在A549、H1650、DMS53细胞株中的表达分别为83.62 ±1.40、90.86±4.78、1.24±0.53，A549、H1650与DMS53细胞株比较，P均＜0.01，A549与H1650细胞株比较无统计学差异。

3　讨论

整合素是位于细胞表面的异二聚体，是连接细胞骨架及细胞外基质的细胞表面受体，其胞内部分(＜70个残基)连接细胞内骨架，较大的胞膜外区域(＞700个残基)与配体结合，以建立细胞内外的联系［6］。整合素通过识别细胞外基质中配体蛋白的特殊序列与配体结合，其中RGD序列是最经典的识别序列。靠近RGD多肽结合位点的氨基酸残基决定了整合素-配体结合特异性及亲和力［7］。目前确认的18种α亚单位和8种β亚单位共同组成至少24种整合素［8］。整合素在正常组织和瘤组织中的表达是不同的，研究人类肿瘤细胞整合素表达与肿瘤类型、级别及病理结果的相关性，可识别整合素在肿瘤的发生及发展过程中的作用。整合素不仅介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的黏附反应，还具有细胞内外信号传导功能［9，10］，整合素可通过传递特定的信号或诱导基因表达来调控肿瘤的转化、生长、侵袭、转移及凋亡［11，12］。整合素的过度表达、缺失或磷酸化影响细胞骨架与细胞外配体的特异结合，整合素表达的变化在肿瘤的发生或抑制过程中起重要作用。大量的研究表明，整合素在恶性肿瘤和同型的癌前病变之间的表达和分布有着显著的差异。整合素表达上调并非总是与肿瘤的发生及转移呈正相关，不同整合素对不同类型肿瘤的形成及转移作用不同。同一整合素在不同肿瘤中的作用也不尽相同。

本研究的整合素家族基因芯片分析结果显示，ITGA3在A549和H1650细胞株中的表达高于其在DMS53细胞株中的表达。且这一结果在RAGE和流式细胞仪检测中得到验证。ITGA3在肺组织的生长发育过程中起重要作用，ITGA3在非小细胞肺癌细胞H1650和A549的表达上调，ITGA3表达下调可使非小细胞肺癌中具有致瘤性的c-myc的表达增强，因而为肿瘤的生长、侵袭和转移创造了条件［13］，ITGA3表达下调同时也预示着肺腺癌患者的预后不良。ITGA3表达的降低与某些恶性肿瘤的发生或其他肿瘤的侵入密切相关［14］，在小细胞肺癌细胞DMS53中，ITGA3的表达下调，这为小细胞肺癌的发生和早期转移提供了物质基础。

总之，三种不同类型的肺癌细胞株中ITGA3表达存在差异，这种表达差异性一方面可作为鉴别小细胞肺癌和非小细胞肺癌的标志物，同时还有望成为肺癌基因治疗新的靶点。

参考文献:

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收稿日期:( 2015-05-11)

通信作者:郭琳琅

基金项目:广东省省级科技计划项目( 2013B021500146)。

文章编号:1002-266X( 2015)31-0025-03

文献标志码:A

中图分类号:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.009