TRAF2基因转染乳腺癌细胞MCF-7增殖情况观察

张晓丽，温志锋，米小轶( 沈阳市妇婴医院生殖中心，沈阳000;中国医科大学附属第一医院)

TRAF2基因转染乳腺癌细胞MCF-7增殖情况观察

张晓丽1，温志锋2，米小轶2
( 1沈阳市妇婴医院生殖中心，沈阳110001;2中国医科大学附属第一医院)

摘要:目的观察TRAF2基因转染乳腺癌细胞MCF-7增殖情况。方法转染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874质粒于MCF-7细胞，以空质粒pcDNA3作为阴性对照。MTT法检测细胞增殖能力，Western blotting法检测细胞中NF-κB的核表达。结果转染空质粒、转染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874质粒的MCF-7细胞48 h的吸光度值分别为0.313±0.019、0.606±0.007，72 h分别为0.708±0.193、1.332±0.075，96 h分别为0.936±0.203、1.462± 0.231，两者比较，P均＜0.001。转染空质粒、转染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874质粒的MCF-7细胞NF-κB的核表达分别为0.789±0.236、1.169±0.369，两者比较，P＜0.01。结论TRAF2基因转染乳腺癌细胞MCF-7增殖能力增强。

关键词:乳腺肿瘤;肿瘤坏死因子受体相关因子2;核转录因子κB;细胞增殖

肿瘤坏死因子受体相关因子( TRAF)是一类重要的胞质衔接蛋白，它能够与肿瘤坏死因子受体( TNFR)超家族成员等多种细胞表面受体的胞质部分结合，从而调节正常以及肿瘤细胞的增殖、存活、凋亡。目前已经发现7种TRAF家族成员( TRAF1 ～7)，其中TRAF2是这一信号调节网络的中心环节。TRAF2接受TNF-α的刺激后，可以调节JNK-c-JUN、Iκκ/NF-κB信号级联反应的激活［1］。且TRAF2可以与TRAF1、TRAF3、TRAF4及TRAF6相互结合［2～5］。但有关TRAF2在肿瘤中的具体作用机制还不十分清楚，因此本研究观察了TRAF2基因转染乳腺癌细胞MCF-7增殖情况。

1　材料与方法

1.1细胞培养人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A、人乳腺癌细胞系MCF-7购自美国菌种保藏中心。MCF-10A用DMEM/F12( 1∶1)培养基培养，并添加5%马血清、10 μg/mL胰岛素及20 ng/mL表皮生长因子。MCF-7用添加10%标准胎牛血清及100 U青链霉素的DMEM培养基培养。所有上述细胞均在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2 MCF-7细胞TRAF2基因转染方法hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874序列购自Addgene公司(美国)。Attractene质粒转染试剂购自Qiagen公司(德国)。根据制造商说明书进行转染实验。空质粒pcDNA3作为阴性对照。

1.3 TRAF2、NF-κB蛋白检测采用Western blotting法检测MCF-10A及MCF-7中的TRAF2及NF-κB蛋白。采用美国Pirece公司的NE-PER核质蛋白抽提试剂盒，根据说明书进行抽提细胞核蛋白。检测转染空质粒、转染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874质粒后MCF-7细胞中NF-κB的核表达。细胞经预冷的PBS清洗3次，加入适量细胞裂解液，提取总蛋白。加样，上样蛋白量为50 μg。聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜后，室温下5%正常小牛血清封闭2 h，将膜放在含相应一抗的封闭液中［抗TRAF2( 1∶1 000)、NF-κB( 1∶500)、βactin( 1∶1 000)、Lamin B1( 1∶500)］，4℃孵育过夜，与相应二抗室温孵育2 h，膜取出后加入ECL显色液。自动电泳凝胶成像分析仪采集结果，进行灰度值测定。实验重复3次以上，取平均值。

1.4 TRAF2基因转染MCF-7细胞增殖情况采用MTT法。取处于对数生长期的MCF-7细胞转染空质粒或hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874质粒。MCF-7细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液(细胞密度3×105个/mL)，分别接种于4个96孔板培养板，细胞培养24、48、72、96 h后分别加入MTT( 5 mg/mL) 20 μL，继续孵育4 h后，每孔加入150 mL DMSO溶解结晶，选择波长550 nm，在酶联免疫( ELISA)检测仪上测定各孔吸光度。实验重复5次，结果取平均值。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

MCF-10A、MCF-7细胞系中TRAF4蛋白表达分别为0.385±0.123、0.723±0.223，两者比较，P＜0.01。转染空质粒、转染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874质粒的MCF-7细胞，48 h的吸光度值分别为0.313±0.019、0.606±0.007，72 h分别为0.708± 0.193、1.332±0.075，96 h分别为0.936±0.203、1.462±0.231，两者比较，P均＜0.01。转染空质粒、转染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874质粒的MCF-7细胞NF-κB的核表达分别为0.789±0.236、1.169±0.369，两者比较，P＜0.01。

3　讨论

TNF诱导细胞凋亡的作用是通过许多信号分子共同参与完成的一个网络工程，其中TRAFs家族蛋白，尤其是TRAF2，是这一信号调节网络的中心环节。TRAF2在接受TNF-α的刺激后，可以调节JNK-c-JUN以及Iκκ/NF-κB信号级联反应的激活。最近报道指出，由凋亡抑制因子( cIAP1及cIAP2)、TRAF2、TRAF3、JNK组成的复合物在非经典NF-κB激活中起重要作用。TRAF2募集cIAP1及cIAP2，激活cIAPs，并激活K63相关泛素化作用［6～8］。基因敲除实验发现，TRAF2可以抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。另一方面，氧化应激所导致的TRAF2磷酸化能显著促进由于Iκκ激活延长以及JNK激活时期缩短所导致的细胞存活［9～12］。

本研究发现，乳腺癌细胞MCF-7中的TRAF2表达高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A，表明TRAF2可能与乳腺癌细胞的增殖有关。本研究还发现，TRAF2基因转染乳腺癌细胞MCF-7后可显著增强细胞NF-κB的核转位，并且明显促进该细胞的增殖能力。TRAF2在胰腺癌细胞系中可与CD40相结合，并能促进JNK的激活和NF-κB报告基因的活化［13］。推测TRAF2在MCF-7细胞中可能通过某种方式激活NF-κB的核转位从而促进该细胞的增殖。

综上可见，TRAF2在乳腺癌细胞中高表达，TRAF2基因转染乳腺癌细胞MCF-7增殖能力增强。这可能是由于TRAF2可通过激活NF-κB的核转位促进乳腺癌细胞的增殖，其具体的作用机制以及其中是否还有其他TRAF家族成员的参与还需要我们进一步探讨。

参考文献:

［1］Shih VF，Tsui R，Caldwell A，et al.A single NFkappaB system for both canonical and non-canonical signaling［J］.Cell Res，2011，21( 1) : 86-102.

［2］Vallabhapurapu S，Matsuzawa A，Zhang W，et al.Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling［J］.Nat Immunol，2008，9( 12) : 1364-1370.

［3］张晓丽，王健，姜彦多，等.TRAF1的表达及其与TRAF2结合的改变与不同乳腺癌细胞系转移潜能的关系［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18( 4) : 386-391.

［4］Zhang X，Wen Z，Sun L，et al.TRAF2 regulates the cytoplasmic/nuclear distribution of TRAF4 and its biological function in breast cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，436( 2) : 344-348.

［5］Hauer J，Puschner S，Ramakrishnan P，et al.TNF receptor ( TNFR) -associated factor ( TRAF) 3 serves as an inhibitor of TRAF2/5-mediated activation of the noncanonical NF-kappaB pathway by TRAF-binding TNFRs［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102 ( 8) : 2874-2879.

［6］Zarnegar BJ，Wang Y，Mahoney DJ，et al.Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1，cIAP2，TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK［J］.Nat Immunol，2008，9( 12) : 1371-1378.

［7］Shih VF，Tsui R，Caldwell A，et al.A single NFkappaB system for both canonical and non-canonical signaling［J］.Cell Res，2011，21( 1) : 86-102.

［8］Zhang W，Zhang X，Wu XL，et al.Competition between TRAF2 and TRAF6 regulates NF-kappaB activation in human B lymphocytes［J］.Chin Med Sci J，2010，25( 1) : 1-12.

［9］Zhang L，Blackwell K，Altaeva A，et al.TRAF2 phosphorylation promotes NF-kappaB-dependent gene expression and inhibits oxidative stress-induced cell death［J］.Mol Biol Cell，2011，22( 1) : 128-140.

［10］Villanueva JE，Malle EK，Gardam S，et al.TRAF2 regulates peripheralT-cell and NKT-cell homeostasis by modulating sensitivity to IL-15［J］.Eur J Immunol，2015，30( 4) : 110-116.

［11］Vy Tran AH，Hahm SH，Han SH，et al.Functional interaction between hMYH and hTRADD in the TNF-α-mediated survival and death pathways of HeLa cells［J］.Mutat Res，2015，777( 15) : 11-19.

［12］Chia-Lan T，Chen WC，Hsieh HL，et al.Erratum to: TNF-α induces MMP-9 expression and soluble ICAM-1 release via TRAF2，c-Src，MAPKs and NF-κB inosteoblast-like MC3T3-E1 cells［J］.J Biomed Sci，2015，22( 1) : 20.

［13］Bishop GA，Moore CR，Xie P，et al.TRAF proteins in CD40signaling［J］.Adv Exp Med Biol，2007，597( 1) : 131-151.

收稿日期:( 2015-05-09)

文章编号:1002-266X( 2015) 31-0023-02

文献标志码:A

中图分类号:R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.008