自限性和慢性HBV感染患者IFN-ω1、IFNGR基因的单核苷酸多态性观察

王亚莉，赖翼，刘阳，胡章勇，杨军，邓兰(成都医学院第一附属医院，成都610500)

自限性和慢性HBV感染患者IFN-ω1、IFNGR基因的单核苷酸多态性观察

王亚莉，赖翼，刘阳，胡章勇，杨军，邓兰
(成都医学院第一附属医院，成都610500)

摘要:目的观察自限性和慢性乙型肝炎病毒( HBV)感染患者干扰素ω1( IFN-ω1)、干扰素γ受体( IFNGR)基因的单核苷酸多态性( SNP)。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法检测206例自限性HBV感染者(对照组)和210例慢性HBV感染者(病例组) IFN-ω1基因上4个SNP位点、IFNGR基因上4个位点，比较两组基因型和等位基因频率。结果病例组、对照组IFNGR基因的rs9376267位点CT基因型频率分别为48.4%、60.3%，两组比较，P =0.012。两组IFN-ω1、IFNGR基因其他SNP位点基因型和等位基因频率比较差异无统计学意义。结论自限性HBV感染患者IFNGR基因上的rs9376267位点CT基因型频率较慢性HBV感染患者高。

关键词:干扰素ω1;干扰素γ受体;乙型肝炎病毒感染;基因单核苷酸多态性

Observation of gene single nucleotide polymorphisms of IFN-ω1 and IFNGR in self-limiting HBV infection and chronic HBV infection patients

WANG Ya-li，LAI Yi，LIU Yang，HU Zhang-yong，YANG Jun，DENG Lan
( The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China)

Abstract:Objective To observe the gene single nucleotide polymorphisms ( SNPs) of interferon-ω1 ( IFN-ω1) and interferon-γ receptor ( IFNGR) in self-limiting hepatitis B virus ( HBV) infection and chronic HBV infection patients.Methods PCR-RFLP was used to detect four SNP sites of IFN-ω1 and four sites of IFNGR in 206 cases of patients with self-limiting HBV infection ( control group) and 210 cases of patients with chronic HBV infection ( case group).The genotype and allele frequency of the two groups were compared.Results The rs9376267 gene loci CT genotype frequencies of IFNGR in the case group and control group were respectively 48.4% and 60.3% ( P =0.012).No statistically significant difference was found between the two groups in the genotype and allele frequency of other SNP sites of IFN-ω1 and IFNGR genes.Conclusion The CT genotype frequency on IFNGR rs9376267 site in patients with self-limiting HBV infection was higher than that of the patients with chronic HBV infection.

Key words:interferon-ω1; interferon-γ receptor; hepatitis B virus infection;gene single nucleotide polymorphism

乙型肝炎病毒( HBV)感染是目前世界上最主要的感染性疾病之一，人感染HBV可分为自限性HBV感染和慢性HBV感染。在相同的环境和膳食因素影响下，部分人会表现出对慢性HBV感染的易感性。HBV感染人体后表现出不同的临床类型，与宿主基因的易感性、免疫细胞、免疫因子、病毒的基因型(亚型)、变异特征和环境因素等有关。干扰素( INF)具有抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化等作用，在HBV感染者免疫细胞因子中占据重要地位。因此，我们通过查单核苷酸多态性( SNP)数据库，筛选了IFN-ω1、IFN-γ受体( IFNGR)基因上SNP位点( rs1895673、rs10757189、rs10511694、rs10964859、rs9376267、rs1327475、rs7749390、rs3799488)。本研究观察了自限性和慢性HBV感染患者IFN-ω1、IFNGR基因的SNP，为协助疾病预测分析和指导临床治疗提供依据。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2010年12月～2013年12月

成都医学院第一附属医院住院或门诊就诊的HBV感染患者。根据2010年12月颁布的《慢性乙型肝炎防治指南》标准，分为慢性HBV感染者(病例组)、自限性HBV感染者(对照组)。病例组为凡是乙肝五项检查提示HBsAg +的患者，包括无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、乙肝相关性肝癌，排除存在其他慢性肝病的致病因素(非HBV病毒感染、自身免疫性肝炎、脂肪肝等)者。对照组患者为凡是未经过治疗，乙肝五项检查结果为HBsAg－、HBsAb +、HBeAg－、HBeAb +、HBcAb +或HBsAg－、HBsAb +、HBeAg－、HBeAb +、HBcAb－或HBsAg－、HBsAb +、HBeAg－、HBeAb－、HBcAb +者。

1.2 IFN-ω1、IFNGR基因SNP基因型和等位基因频率检测由上海天昊遗传分析中心设计和合成8对引物。rs9376267上游引物为5'-GGCTACAATGAGGATGGCCAATTT-3'，下游引物为5'-AGCCCTGCACACCCCAGAG-3'; rs1327475上游引物为5'-TGCTTCCAACATCTTTGTGATCGT-3'，下游引物为5'-TGTTCAACTTTTGCAGTGGCCATA-3'; rs7749390上游引物为5'-GAAAGGCAACCGACGAGTTCAA-3'，下游引物为5'-TTTCTCCTACCCCTTGTCATGCAG-3'; rs3799488上游引物为5'-TTGCTGGAGACAACGGCTCTTC-3'，下游引物为5'-TGTGCCATTTGGTGGTCCATTAC-3'; rs1895673上游引物为5'-CCACATTCTTCTCTAGATGCCACCTT-3'，下游引物为5'-GTGAGGGCTGAGCTGTCCTACTG-3'; rs10964859上游引物为5'-CCGTCCATTCCTTGATTTGGTTC-3'，下游引物为5'-GGTTCAGGGGCATCAGTCCCTA-3'; rs1075 7189上游引物为5'-TGCTGTTTTATTCACAACAGAGGATGA-3'，下游引物为5'-TGTGAGGAGACGCTGGGAAA-3'; rs10511694上游引物为5'-TCCCAGGGAGCAGTCTCACAAC-3'，下游引物为5'-ATGGGTCAGGAGGAAAGGAGGT-3'。留取研究对象的外周血标本，提取基因组DNA，取EDTA抗凝静脉血2 mL，分装，－20℃冻存，采用大连宝生物公司提供基因组提取试剂盒提取基因组DNA，－20℃分装冻存，详细记录每名入选者的临床资料。PCR1反应体系( 20 μL)包含1×缓冲液(大连宝生物工程有限公司)、3.0 mmol/L Mg2 +、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq聚合酶( Qiagen公司)、1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR2反应体系( 10 μL)包含1×GC缓冲液(大连宝生物工程有限公司)、3.0 mmol/L Mg2 +、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq聚合酶( Qiagen公司)、1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。SNP位点中5个适用于PCR1反应体系，rs1327475的上下游引物浓度均为2 μmol/L，rs1895673、rs3799488、rs9376267、rs10757189的上下游引物浓度均为1 μmol/L;3个适用于PCR2反应体系，其中rs10964859、rs7749390的上下游引物浓度均为2 μmol/L，rs10511694的上下游引物浓度均为1 μmol/L。PCR循环程序为95℃2 min，11个循环( 94℃20 s，65℃依次递减0.5℃循环40 s，72℃1 min 30 s)，24个循环( 94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min)，72℃2 min，4℃。在10 μL PCR产物中加入1 U SAP酶和1 U ExonucleaseⅠ酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。rs7749390SR延伸引物为5'-CCGTCCTCAGGTACCGTCG-3'，rs10511694SF延伸引物为5'-TTTTTTTTGGACCCTGGCTCTCAGTGG-3'，rs10757189SR延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACCTTGTGGTCCCAGTGAAG-3'，rs10964859 SR延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACATGTTCAGCTTTCSATTTG-3'，rs1327475SR延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAAACATTACCTGAAGCAGATG-3'，rs1895673SF延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTctTATTTCCTTTTTCCACTTGACAAAC-3'，rs3799488SF延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAGTAGCACTTCTTACCACAGASATCTA-3'，rs9376267SF延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACACATTCCAGTTTCATCAACA-3'。延伸反应体系( 10 μL)包括5 μL SNaPshot Multiplex Kit ( ABI)、2 μL纯化后多重PCR产物、1 μL延伸引物混合物、2 μL超纯水。rs1895673SF、rs3799488SF、rs9376267SF、rs10757189SR、rs10511694SF引物浓度均为0.8 μmol/L，rs1327475SR、rs7749390SR引物浓度均为1.6 μmol/L，rs10964859SR引物浓度为2.4 μmol/L。PCR循环程序为96℃1 min，28个循环( 96℃、10 s，50℃、5 s，60℃、30 s)，4℃。在10 μL延伸产物中加入1 U SAP酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5 μL LIZ120 Size Szandard、9 μL Hi-Di混匀，95℃变性5 min后上ABI3130XL测序仪，用GeneMapper 4.0 ( Applied Biosystems Co.Ltd.，USA)分析原始数据。

1.3统计学方法采用SPSS12.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用t检验;计数资料比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

病例组210例，其中男126例、女84例，年龄

( 44.6±13.8)岁;对照组206例，其中男103例、女103例，年龄( 44.6±14.8)岁。两组年龄比较，t = －0.002，P = 0.998。两组性别分布比较，χ2= 4.202，P =0.04。

实验过程中发现部分杂合子位点偏离正常分布，原因可能为样本有效浓度极低或严重污染，分型数据可靠性低，故删除，数据分析时对照组189例、病例组192例。病例组、对照组rs1895673位点AA基因型频率分别为59.9%、64.0%，AG基因型频率分别为37.5%、29.6%，GG基因型频率分别为2.6%、6.3%; rs10757189位点GG基因型频率分别为36.5%、36.5%，GA基因型频率分别为49.5%、46.6%，AA基因型频率分别为14.1%、16.9%; rs10511694位点CC基因型频率分别为28.6%、28.6%，CT基因型频率分别为53.6%、49.2%，TT基因型频率分别为17.7%、22.2%; rs10964859位点CC基因型频率分别为71.4%、71.4%，CG基因型频率分别为26.0%、27.0%，GG基因型频率分别为2.6%、1.6%; rs9376267位点CC基因型频率分别为31.8%、22.2%，CT基因型频率分别为48.4%、60.3%，TT基因型频率分别为19.8%、17.5%; rs1327475位点GG基因型频率分别为78.6%、79.9%，GA基因型频率分别为19.8%、19.6%，AA基因型频率分别为1.6%、5.0%; rs7749390位点GG基因型频率分别为33.3%、31.2%，GA基因型频率分别为49.0%、55.6%，AA基因型频率分别为17.7%、13.2%; rs3799488位点TT基因型频率分别为54.7%、52.9%，TC基因型频率分别为39.6%、41.8%，CC基因型频率分别为5.7%、5.3%。两组rs9376267位点CT基因型的频率比较，P =0.012。两组其他SNP位点基因型频率比较无统计学差异。

病例组、对照组rs1895673位点等位基因A分布频率分别为78.5%、78.8%，等位基因G分布频率分别为21.4%、21.2%; rs10757189位点等位基因G分布频率分别为61.2%、59.8%，等位基因A分布频率分别为38.8%、40.2%; rs10511694位点等位基因C分布频率分别为55.5%、53.2%，等位基因T分布频率分别为44.5%、46.8%; rs10964859位点等位基因C分布频率分别为84.4%、84.9%，等位基因G分布频率分别为15.6%、15.1%; rs9376267位点等位基因C分布频率分别为56.0%、52.4%，等位基因T分布频率分别为44.0%、47.6%; rs1327475位点等位基因G分布频率分别为88.5%、89.7%，等位基因A分布频率分别为11.5%、10.3%; rs7749390位点等位基因G分布频率分别为57.8%、59.0%，等位基因A分布频率分别为42.2%、41.0%; rs3799488位点等位基因T分布频率分别为74.5%、73.8%，等位基因C分布频率分别为25.5%、26.2%。两组上述SNP位点的等位基因分布频率比较无统计学差异。

3　讨论

HBV感染机制尚不清楚，除与HBV病毒本身(病毒含量、病毒变异、病毒基因型等)、环境因素有关外，还与宿主机体的免疫状况等有关。近年来发现宿主抗HBV的基因的多态性，在HBV感染后不同的临床转归及其易感性方面也发挥着重要作用。机体清除HBV需要先天性和后天性细胞和体液免疫反应的共同参与，细胞因子在这个过程中起着非常重要的作用［1］。在清除HBV的过程中，机体的免疫功能，尤其是特异性细胞免疫功能发挥着重要的作用，它启动机体释放大量免疫细胞因子清除HBV。IFN是细胞和机体受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等作用后，由受体细胞分泌的一种广谱抗病毒糖蛋白。IFN是多功能蛋白，可以直接作用或者通过诱导、活化其他蛋白，调节多种反应。根据免疫原性和分子结构的不同，可将INF分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IFN-κ各型，每型还存在多种结构序列不同的亚型。其中IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-κ具有抗酸性作用，合称为Ⅰ型IFN。IFN-γ对酸性敏感，称为Ⅱ型IFN或免疫IFN，主要参与诱导主要组织相容性抗原( MHC)的表达和免疫调节效应［2］。IFN通过与靶细胞表面的相应受体结合，诱导靶细胞合成抗病毒蛋白( AVP)，如蛋白激酶( PKR)、磷酸二脂酶、2-5腺苷酸合成酶、RNase L、MxA蛋白等。这些AVP能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质、降解病毒mRNA;有的抑制转录酶，阻止病毒mRNA的形成;还有的能抑制病毒DNA和RNA的合成，达到抗病毒作用。IFN能提高巨噬细胞、NK细胞、毒性T淋巴细胞( CTL) 和B淋巴细胞的杀伤水平而增强机体抗肿瘤能力，能诱导细胞凋亡和TNF-α、TRAIL的产生及分泌，共同促进细胞调亡，故在众多免疫细胞因子中占据了重要地位，其SNP影响着HBV感染者的转归。

细胞因子的表达量受基因调控，位于基因表达调控区序列的SNP影响基因的表达量，在疾病的个体差异方面有重要意义。IFN-γ特异结合IFNGR，细胞表面的这些受体具有数量少、亲和力高和种族持异性的特点，能促进IFN-γ分泌。目前许多学者对IFN-γ基因上部分SNP位点与HBV感染相关性

的研究较多，但对于IFNGR及IFN-ω与HBV感染的相关性研究尚不多。Zhou等［3］研究了IFNGR多个SNP位点，发现在IFNGR启动子上的－56C/T SNP与HBV感染结局有关。Cheong等［4］研究了IFN-γ、IFNGR及IFN调控因子1上的部分位点，发现这些位点与HBV易感性无明显相关。Oliver等［5］报道了IFNGR启动子的多态性在不同的细胞环境中有相反的效应。通过筛查SNP数据库，目前已证实的中国人群IFNGR基因上的SNP位点有11个，在其转录调控及外显子区域中，次要等位基因频率( MAF)大于0.1的SNP位点共4个，IFNGR的表达水平可能与这些SNP位点相关，影响IFN-γ的表达水平，目前尚无对上述SNP位点与HBV感染相关性的研究。此外，有研究证明IFN-ω基因中有多个家族成员，主要是IFN-ω1有功能，其具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节的作用。Flores等［6］研究证实IFN-ω可影响IFN-α、IFN-β的表达水平。还有研究［7，8］表明，从牛的基因组DNA提取出的IFN-ω即使跨种属也具有较高的抗病毒活性，它在体外抗乙肝病毒的活性与IFN-α相当，IFN-ω不仅在体外能够抑制慢性髓性白血病患者骨髓祖细胞的生长，而且能够上调乳腺癌和结肠癌细胞系表面MHCⅠ类分子的表达，这些结果表明IFN-ω在体外有抗肿瘤、抗增殖和免疫调控效应［9］。IFN-ω1基因上的SNP位点与HBV感染的关系较少有研究报道，通过SNP数据库发现中国人群IFN-ω1基因上的SNP位点有7个，在其转录调控及外显子区域中，MAF大于0.1 的SNP位点有4个，IFN-ω1的表达水平可能与这些SNP位点相关。本研究结果显示，自限性HBV感染患者IFNGR基因上的rs9376267位点CT基因型频率较慢性HBV感染患者高。这些均提示携带IFNGR的rs9376267CT基因型的人群不是慢性HBV感染的易感基因型，这类人群乙肝慢性化的发生率低。

参考文献:

［1］邹晓毅，姚云清.机体清除乙型肝炎病毒免疫机制研究新进展［J］.国外医学:病毒学分册，2005，12( 2) : 42-45.

［2］武迎红，王学理，段小宇，等.干扰素的研究进展［J］.内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2007，22( 4) : 425-428.

［3］Zhou J，Chen DQ，Poon VK，et al.A regulatory polymorphism in interferon-gamma receptor 1 promoter is associated with the susceptibility to chronic hepatitis B virus infection［J］.Immunogenetics，2009，61( 6) : 423-430.

［4］Cheong JY，Cho SW，Chung SG，et al.Genetic polymorphism of interferon-gamma，interferon-gamma receptor，and interferon regulatory factor-1 genes in patients with hepatitis B virus infection［J］.Biochem Genet，2006，44( 5-6) : 246-255.

［5］Oliver K，Dominic P.Kwiatkowski，et al.Context-specific functional effects of IFNGR1 promoter polymorphism［J］.Hum Mol Genet，2006，15( 9) : 1475-1481.

［6］Flores I，Mariano TM，Pestka S.Human interferon omega ( omega) binds to the alpha/beta receptor［J］.J Biol Chem，1991，266 ( 30) : 19875-19877.

［7］Rodríguez M，Martínez V，Alazo K，et al.The bovine IFN-omega 1 is biologically active and secreted at high levels in the yeast Pichia pastoris［J］.J Biotechnol，1998，60( 1-2) : 3-14.

［8］Hagelstein J，Kist A，Stremmel W，et al.Antiviral potential of interferon-omega on hepatitis B virus replication in human hepatoma cells［J］.Arzneimittelforschung，1998，48( 3) : 343-347.

［9］马丽丽，杨吉成.新的干扰素的研究进展［J］.国外医学:微生物学分册，2005，28( 1) : 15-17.

收稿日期:( 2015-04-21)

作者简介:第一王亚莉( 1980-)，女，主治医师，主要研究方向为病毒性肝炎的诊断与治疗。E-mail: 447243359@ qq.com

基金项目:四川省卫生厅科研项目( 100098)。

文章编号:1002-266X( 2015) 31-0001-04

文献标志码:A

中图分类号:R512.6

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.001