转基因鸡禽流感抗病育种的研究进展

范金明 陈昌如 周亚俊 冒留留

(江苏省如东县丰利畜牧兽医站,江苏如东 226008)

转基因鸡禽流感抗病育种的研究进展

范金明 陈昌如 周亚俊 冒留留

(江苏省如东县丰利畜牧兽医站,江苏如东 226008)

禽流感不仅对家禽生产带来巨大损失,更重要的还威胁到人类安全,在该病防控研究方面,虽然通过不同亚型不同地区的流行情况制作了疫苗,但由于其变异性强等特性,防治效果并非完全有效,将转基因技术用于抗病育种为从根本上达到抗禽流病毒感染提供了可能,因此,笔者将家禽转基因的制作方法和禽流感抗病育种的研究现状进行了简单介绍。

鸡;转基因;禽流感;抗病育种

禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合症，自从19世纪80年代意大利大规模暴发禽流感造成重大经济损失以后，人们就开始了对该病的研究[1]，我国在1997年香港大规模暴发H5N1禽流感病毒感染人并致人死亡的事件发生后更加加强了对禽流感的研究和重视[2]，也根据不同地区的禽流感流行情况研制出了不同亚型的疫苗，鉴于该病的变异性强、亚型多等原因，禽流感疫苗所取得的对该病的免疫效果一直不理想。面对越来越复杂的的禽流感流行现状，如何多途径的对该病的进行根本性的防控，是目前迫切解决的问题，因此研究抗禽流感病毒转基因鸡并进行抗病育种，是一条禽流感防治的有效途径，也是从根本上攻克禽流感病毒的一项重要技术。

1 转基因家禽制作方法

1.1 精子载体法

精子在输卵管内与卵子结合时能准确找到卵子的雌性原核的特性，直接采用外源DNA或阳离子质体包埋外源DNA与成熟精子共孵育后，通过人工授精获得转基因鸡，这种方法简单、成功率高，具有较高的研究价值。Collares等运用脂质体和REMI改进了精子摄取外源DNA量，并成功制备转因鸡。Collares等用运用SMGT法制备带有pEGFP-N1基因的转基因鸡，通过PCR和反转录PCR检测，新生雏鸡的转基因数据也很可观。Nakanishi研究发现鸡的精子与脂质体DNA复合体混合培养能够在大多数精子头部检测到外源DNA，这说明鸡精子头部有一定的吸附外源DNA的能力，并且通过进一步的实验发现，这些精子具有正常的受精能力和高效率生产转基因胚盘的能力。Squries根据精子膜的这一特性和相似相溶原理将外源DMA与鸡精子共孵育，并且检测出了阳性表达。

1.2 胚盘下腔注射法

刚产出的种蛋中，含有类似ES细胞的干细胞和原始生殖细胞，利用显微注射的方法将各种载体携带的外源基因导入胚盘下腔可以转染，Kwon等通过胚盘注射法将表达EGFP基因的逆转录病毒载体导入129枚鸡胚中，孵化21d后获得13只表达该外源基因的雏鸡。Shinji等通过胚盘下腔注射逆转录莫洛尼鼠白血病病毒导入鸡胚中，134个鸡胚其中37个成功孵化。Petitte等通过将含隐性白羽性状鸡的胎盘细胞注入到含显性白羽性状鸡的胚下腔中，获得11.3%的嵌合体胚胎，通过筛选胎盘中央区细胞，已将嵌合比率提高到35%，Etches等和Naito都利用这一方法获得了转基因嵌合体。

1.3 血液注射法

PGCs细胞在机体的发育过程中具有特殊的运行路线，鸡的PGCs存在于第X期鸡胚的胚盘下腔中，随着血的发育而进入血液循环系统中并随着血液进行循环，在第14至15期时，血液中的PGCs细胞达到高峰，至24期时，PGCs细胞开始定殖于生殖脊部位，并分化成卵巢中的卵原细胞或精巢内的精原细胞。根据这一特性，Masamichi Kamihira等人将逆转录病毒注射入卵化55h的鸡心脏中，并获得了可在鸡血清和鸡蛋中高效表达的scFv-FC，Yoshinori Kawabe等也用相同的方法获得了转基因的鹌鹑。PGCs转基因法主要针对生殖细胞的转基因，不考虑体细胞的嵌合问题，供体细胞在形成种系细胞后能够进一步发育成携带外源基因的功能配子，对转基因检测和后代筛选有重要意义，但可获得的PGCs细胞数量少，培养条件还不成熟，PGCs转基因操作比较困难，在该技术的应用过程中有一定的限制性。

1.4 反转录病毒法

反转录病毒是依赖RNA进行复制的RNA病毒，感染宿主细胞后病毒基因反转录成DNA，即前病毒DNA，DNA前病毒可以整合到染色体上，从而将所携带的外源基因插入到宿主染色体上。反转录病毒的整合只能发生在M期，发生在胚胎发育的晚期，只有部分细胞或组织获得外源基因。Garba等将Mx1基因转至鸡细胞中，使鸡获得了对禽流感的抗性。Kamaura等用与MDV mRNA互补的一段寡核苷酸转至鸡体内，也使鸡获得了抗性。

2 Mx基因多态性与抗流感病毒相关性研究

Mx基因外显子上存在多个突变位点，通过研究发现，631与2032位点基因突变与鸡流感抗病性可能存在一定的相关性，具有一定的研究和参考价值。

2002年Ko等[3]通过分析25个不同品种鸡的Mx蛋白发现鸡的Mx基因呈多态性分布，通过与白来航鸡核苷酸序列比较，25个有差异的们点中有11个碱基发生了同义突变，而另外14个发生了错义突变，通过载体转染的方法发现构建的7个不同品系的Mx蛋白中只有一部分能抵抗流感病毒和VSV感染。进一步比较氨基酸多态性与Mx蛋白抗病毒活性的关系发现鸡Mx蛋白第631位点为天冬酰胺（Asn）时，该蛋白具有抗流感病毒活性，而表达为丝氨酸（Ser）时不能阻止病毒增殖。并且将筛选出来的基因插入正常正细胞中，增强其抵抗H5N1型和其他类型禽流感病毒的能力，研究还发现，很多品种的鸡体内该基因都存在缺陷。

2008年Benfield等[4，5]公布鸡Mx基因由14个外显子组成，引起631位点多态性的位点位于最后一个外显子上，并且该突变位点多态性表达为Asn时并不能保护鸡抵抗H1N1型病毒感染。

Li等[5]检测红色原鸡、15个中国地方品种鸡和4种商品鸡第2032位等位基因A和G的频率，结果显示易感基因G的频率为0.0446～0.9435，抗生基因A的频率为0.9554。其中地方品种鸡等位基因A的频率为0.7241～0.9554，显著高于商品鸡（0.0565～0.2742）。

Wu等[6，7]对15个不同品种鸡的Mx基因2032位进行单核苷酸多态性分析，结果显示，检测样品中存在3种基因型（AA、AG、GG），携带易感等位基因G和抗性等位基因A的频率分别为0.650和0.350，其中红色原鸡中等位基因A所占频率为0.984，显著高于地方品种（0.321），提示Mx基因2032位呈现多态性，且原始品种鸡的抗病能力较强。

2010年Xiangqun Ye等[8，9]用Real Time等用Real Time PCR的方法对Mx基因2032位碱基因进行了基因分型，对于采自白来航鸡的97个血液样本通过其溶解曲线进行SNP检测，此方法对于传统PCR具有快速、灵敏、易操作等优点。

3 展望

抗病育种在控制疾病方面提供了新的途径，已在许多领域得到了取得了一定的成就，在家畜家禽抗性基因研究中已经筛选了大量的基因，并且与相关抗病性状进行关联，为人类在抗病育种研究方面提供了许多有价值的参考材料。在禽流感抗病育种研究方面，人们也筛选 出了许多可能存在的与禽流感易感性相关的基因，特别是对Mx基因位点的多态性与抗病性状的相关性向我们提示了其作为抗病基因的可能，国内外抗病育种专家也进行了越来越深的研究，为抗禽流感转基因鸡的制作提供了很好的参考依据，为攻克禽流感的流行难题奠定了一定基础，相信在不久的将来，随着基因导入技术、外源基因选择表达技术的深入研究和提高，转基因鸡抗禽流感的研究一定能够以实质性的变化展现在人们面前。

[1] 丁兆忠，苗向阳，孙世铎.抗禽流感病毒转基因鸡研究进展[J].中国畜牧兽医，2006，33（11）：1-2.

[2] 苷孟侯.禽流感[M].北京：北京农业大学出版社，1995：18-30.

[3] 吴晓伟，范敏其，倪黎纲等.鸡Mx基因2032位点单核苷酸多态性研究[J].中国畜牧杂志，2009，45（5）：1-5.

[4] 陈化兰，于康震，卢景良.禽流感病毒及其分子生物学研究进展[J].国外兽医学畜禽传染病，1997，2（1）：3-7.

[5] Squires EJ，Drake D.Liposome-mediated DNA transfer to chicken sperm cell[J].Mol Reprod Dev，1993，36（2）：258-261.

[6] 崔尚金，陈化兰，唐秀英，等.禽流感RT-PCR诊断方法的建立[J].中国畜禽传染病，1998，20（2）：105-107.

[7] 庞有志，赵淑娟.转基因技术与鸡的抗病育种[J].中国兽医科技，1999，29（2）：43-44.

[8] 李文雍，陈清轩.mRNA差异显示技术研究进展[J].农业生物技术学报，2004，12（5）：597-601.

[9] Sompayrac L，Jane S，Burn TC，et al.Overcoming limitations of the mRNA differential display technique[J].Nucleic Acids Res，1995，23（22）：4738-4740.