Survivin-shRNA对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡影响相关研究*

陕西省人民医院骨科(西安710068)

李　勇　秦　静　刘宗智



Survivin-shRNA对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡影响相关研究*

陕西省人民医院骨科(西安710068)

李勇秦静刘宗智

目的：探讨Survivin-shRNA对骨肉瘤MG-63细胞增殖活性、凋亡指数、超微结构变化以及Survivin、VEGF、PCNA及CAS-3蛋白表达水平的影响。方法：骨肉瘤MG-63细胞培养成功后，重组腺病毒Survivin-shRNA转染。细胞以1∶5的比例进行稀释传代培养，挑选稳定转染的细胞并扩增培养用于进一步实验，Survivin-shRNA病毒载体转染的细胞为Survivin-shRNA组，阴性对照为GFP组和CON组。采用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡指数，透射电镜观察细胞超微结构改变，Western blot 法检测SUV、VEGF 、PCNA及CAS-3蛋白的表达变化。结果：腺病毒介导的RNA干扰构建Survivin-shRNA载体，Survivin-shRNA组转染细胞的胞质及胞核可见绿色荧光，并伴有少量小颗粒物质。MTT结果显示：Survivin-shRNA对MG-63细胞增殖有明显抑制作用；流式细胞仪检测结果发现：Survivin-shRNA组与Control组和GFP组相比，细胞早期凋亡率增加，可见核碎裂、凋亡小体；透射电镜可见Survivin-shRNA对MG-63超微结构有明显作用，核固缩，微绒毛消失，染色质浓集靠近于核膜，并可见凋亡小体分离；Westtern blot分析显示：Survivin-shRNA抑制SUV、VEGF和PCNA蛋白的表达，增强了CAS-3蛋白在MG-63细胞中的表达水平。结论：Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能是通过抑制肿瘤新生血管形成或通过调控CAS-3的表达、下调SUV信号通路来完成。

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的骨科恶性肿瘤[1]。研究表明：Survivin与恶性肿瘤的发生、发展以及肿瘤敏感性均有着密切关系。本实验通过构建重组腺病毒载体Survivin-shRNA，转染至骨肉瘤MG-63细胞后，检测细胞增殖活性、细胞凋亡指数、超微结构变化及SUV、VEGF 、PCNA及CAS-3蛋白的表达，评估Survivin-shRNA对MG-63细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制。

材料与方法

1试剂及仪器人骨肉瘤MG-63细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胎牛血清、青链霉素购自美国Gibco公司；MTT、二甲基亚砜及所有抗体(CAS-3、VEGF、PCNA、SUV及二抗)购自美国Sigma公司；细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司。

2MG-63细胞培养液氮中取出人骨肉瘤MG-63细胞，放入37oC水浴箱中使之迅速融化。在超净工作台内吸出细胞悬液，注入含5ml培养液的离心管中，低速离心3min后弃上清，于含10%～15%胎牛血清、100μg/ml青链霉素的DMEM培养液中，置于37oC培养箱培养，当细胞生长贴壁融合度为80%～90%时传代培养。

3Survivin-shRNA转染MG-63细胞为有效敲除MG-63细胞中的Survivin基因，采用腺病毒介导的RNA干扰方法来构建Survivin-shRNA载体，shRNA序列由上海吉凯公司设计并合成。MG-63细胞接种于6孔板，待细胞生长融合至60%～80%，洗涤后进行转染。重组Survivin-shRNA和阴性对照rAd5-GFP转染MG-63细胞，细胞以1∶5的比例进行稀释传代培养，挑选稳定转染的细胞并传代培养用于进一步实验，重组Survivin-shRNA转染的细胞为Survivin-shRNA组，阴性对照为rAd5-GFP组和CON组。

4MTT法检测MG-63细胞增殖抑制率 取对数生长期MG-63细胞，制成单细胞悬液，计数后接种于96孔培养板中，每孔体积200μl，重复4孔，同时设正常生长细胞对照及空白对照。分别孵育24h后，每孔加入20μlMTT培养4h，去上清，每孔加入150μl DMSO，终止反应。将96孔板移入平板震荡器，水平震荡10min。酶联免疫检测仪于490nm波长处测定每孔吸光度(OD)值。增殖抑制率=(l—实验组OD值/对照组OD值)×100%。

5流式细胞术检测细胞凋亡采用 Annexin V/PI双染色法，取对数期生长的MG-63细胞，0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，以105/ml细胞密度接种，用4oC预冷的PBS洗细胞两次，胰酶消化后，1500rpm离心5min后弃上清，收集细胞，用PBS重新悬浮细胞，调节细胞浓度，取l00μl细胞悬液，1500rpm离心5min后弃上清，加入500μl的1×Binding Buffer，加入5μl Annexin V-FITC，再加入10μl PI，轻轻混匀，在室温下，避光反应5～10min；流式细胞仪分析，所得数据输入计算机并用Modifit l.0软件分析凋亡率。

6透射电镜检测MG-63细胞超微结构改变对数期生长的MG-63细胞用0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，以105/ml细胞密度接种于细胞培养板中，待贴壁后更换培养液，0.25%胰酶消化后，低速离心2min，将细胞转移至1.5ml EP管中。将上述细胞样本用2.5%戊二醛固定，送西安交通大学医学院电镜室(TEM)。

7Western blot检测MG-63细胞SUV、VEGF及CAS-3蛋白表达 培养的MG-63细胞同步化后，提取MG-63细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按《分子克隆实验指南》所述方法进行SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚蓝抵达分离胶底部结束电泳，取下凝胶并作标记，入电转缓冲液平衡5min后转膜。纤维素膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。然后抗原抗体反应，并用辣根过氧化物酶化学增强剂显色反应。蛋白的表达水平根据GAPDH进行标化，通过软件进行灰度扫描、定量。

8统计学处理采用SPSS13.0统计学软件包，计量数据以表示，多组样本均数之间比较采用单因素方差分析检验进行处理，以P<0.05为有显著性差异。

结　果

1Survivin-shRNA转染MG-63细胞倒置荧光显微镜下观察，与CON组相比，shRNA组MG-63细胞数量有所减少，且细胞形态改变。CON组细胞未见荧光表达，Survivin-shRNA组转染细胞的胞质及胞核可见绿色荧光，并伴有少量小颗粒物质。

2 Survivin-shRNA对MG-63细胞增殖的影响用MTT法测定细胞的增殖抑制情况，在24h时，CON组的增殖抑制率为14.511.21%，GFP组的增殖抑制率为15.261.39%，而Survivin-shRNA组的增殖抑制率为28.673.07%；另外，在Survivin-shRNA组中，48h、72h所测增值率与24h有显著性差异(P<0.01)，在72h时可达到43.214.12% (P<0.01)。

3Survivin-shRNA对MG-63细胞凋亡的影响经Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测结果发现，转染24h后，与Control组和GFP组相比，Survivin-shRNA组MG-63细胞早期凋亡率增加，表明Survivin-shRNA可诱导MG-63细胞发生凋亡。

4Survivin-shRNA对MG-63细胞超微结构的影响透射电镜下观察细胞超微结构改变，可见Survivin-shRNA对MG-63超微结构有明显影响。细胞体积缩小，微绒毛消失，核固缩，染色质浓集靠近于核膜，并沿核膜收缩，可见具有完整膜性结构的凋亡小体的分离。

5Survivin-shRNA对MG-63细胞蛋白表达的影响用Westtern blot检测分析SUV 、VEGF、PCNA和CAS-3蛋白的表达。Survivin-shRNA组与GFP组和CON组相比，SUV、VEGF和PCNA的表达下降，而CAS-3表达增加，这表明，Survivin-shRNA抑制PCNA的表达，增强了CAS-3 在MG-63细胞中的表达。

讨　论

骨肉瘤源于间叶组织，由纺锤形的恶性肿瘤细胞形成类骨质或不成熟的骨质为特征。骨肉瘤患者中，1/5患者初诊时就已出现肿瘤的远处转移，而骨肉瘤治疗失败和死亡的最主要原因也就是远处转移 。骨肉瘤恶性生物学行为对患者的危害性巨大，转移率和病死率居高不下，常规治疗手段治疗效果不理想[2]。

RNA干扰技术是基因沉默的有力手段，靶向Survivin基因干扰可阻断Survivin表达而抑制肿瘤细胞的生长[3]。与常规的药物相比具有明显的优势：根据靶基因序列按碱基互补原则设计，因此进入细胞后只能作用于靶基因，故特异性强；可阻断靶基因的表达，因此效果较好；作用于局部，对全身影响小，不会产生严重的不良反应。

研究表明：Survivin与恶性肿瘤的发生、发展以及肿瘤敏感性等有着密切联系，已有很多Survivin基因与肿瘤的关系的相关研究进行了深入地探索[3]。由于Survivin在肿瘤的特异性表达，因此下调Survivin是一种提高治疗效果的有效策略[4]。本实验中MTT检测结果显示，Survivin-shRNA对MG-63细胞增殖具有明显的抑制作用，这种抑制作用表现出良好的时间依赖性。利用流式细胞仪对细胞凋亡的分析发现，经一定浓度Survivin-shRNA作用一定时间后，可见细胞凋亡的比例明显升高。

肿瘤的发生是多途径、多步骤的，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生发展密切相关。Caspase家族是细胞凋亡的执行者，当Caspase的活性受到抑制而引起细胞凋亡障碍，就可能引起多种肿瘤的发生。Survivin的表达已被证实与骨肉瘤中PCNA和CAS-3表达相关联[5]。我们的研究发现，敲除MG-63细胞Survivin可下调PCNA的表达和上调CAS-3的表达，提示Survivin可能通过调节PCNA和CAS-3的表达参与骨肉瘤增殖和凋亡。

恶性肿瘤的形成和转移依赖新生血管生成，因此VEGF在整个过程中发挥重要作用。抑制新生血管生成在治疗肿瘤中起重要作用，研究表明通过作用VEGF可影响肿瘤新生血管的生成[6]。我们的研究发现，敲除MG-63细胞Survivin可下调VEGF的表达，提示Survivin可能通过调节抑制肿瘤新生血管形成参与骨肉瘤增殖和凋亡。

[1]Wu PK, Chen WM ,Chen CF,etal. Primary osteogenic sarcoma with pulmonary metastasis: clinical results and prognostic factors in 91 patients [J].Jpn J Clin Oncol,2009,39(8):514-522.

[2]Longhi A, Errani C, De Paolis M,etal.Primary bone osteosarcoma in the pediatric age:state of the art[J].Cancer Treat Rev,2006,32(6):423-436.

[3]Sah NK,Munshi A,Hobbs M,etal. Effect of downregulation of survivin expression on radiosensitivity of human epidermoid carcinoma cells[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,2006,66(3): 852-859.

[4]谈晓红,马鹏.Survivin在胃黏膜癌变过程中的表达及与幽门螺杆菌感染关系探讨[J].陕西医学杂志, 2012,41(11):1457-1459.

[5]Liang X, Da M, Zhuang Z,etal. Effects of Survivin on cell proliferation and apoptosis in MG-63 cells in vitro[J]. Cell Biol Int ，2009，33: 119-124.

[6]Zou J, Gan M, Mao N,etal. Sensitization of osteosarcoma cell line SaOS-2 to chemotherapy by downregulating survivin[J]. Arch Med Res, 2010,41: 162-169.

(收稿：2015-06-20)

The effects of Survivin-shRNA ontumor proliferation and apoptosis of MG-63 cell

Department of Orthopaedics, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Li YongQi JingLiu Zongzhi

Objective:To explore the effects and molecular mechanisms of baicalin on tumor proliferation and apoptosis of MG-63 cell. Methods:MG-63 cells were cultured in DMEM medium and recombinant adenovirus vector Survivin-shRNA and negative control rAd5-GFP were transfected into MG-63 cells. Cells were subcultured at a 1∶5 dilution. Positive stable transfectants were selected and expanded for further study. The clone in which the rAd5-Survivin-shRNA virus vectors transfected was named as Survivin-shRNA group, the negative control vectors transfected was named as GFP group and MG-63 cells were named as CON group. MTT assay was used to detect cell proliferation inhibition rate; flow cytometry detected apoptosis index; TEM detected microscopic morphological changes; Western Blot assay determine the protein expression level of SUV, VEGF, PCNA and CAS-3. Results: After Survivin-shRNA was transfected into MG-63 cells, it was found that knockdown of SUV could significantly reduce the proliferative activities of MG-63 cells compared with GFP group and CON group. knockdown of Survivin markedly increased the apoptotic index of MG-63 cells compared with GFP group and CON group indicated by flow cytometry; real-time PCR and Western blot assays were performed that the mRNA and protein expression level of SUV and PCNA was decreased, while CAS-3 expression was increased in rAd5-SUV group compared with the GFP group and CON group. Conclusion: Survivin-shRNA could inhibited proliferation, induced apoptosis of MG-63 cells in a time-dependent manner. The molecular mechanisms may through VEGF-mediated regulation or regulate the expression of SUV and CAS-3.

Osteosarcoma/ultrastructureProteolipids/metabolismCell apoptosis@Survivin

R738.1

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.006

﹡陕西省科技厅社会发展科技项目(2015SF051)

主题词骨肉瘤/超微结构蛋白脂质类/代谢细胞凋亡@ Survivin