糖尿病诊断和监测的金标准—HbA1c

沈　霞

糖尿病诊断和监测的金标准
—HbA1c

沈霞

作者单位：200092上海市，上海交通大学医学院附属新华医院检验科

糖化血红蛋白是人体血液中葡萄糖与血红蛋白链上的游离氨基酸之间非酶促糖化作用的产物。血红蛋白A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）是糖化血红蛋白的主要成分，既不受胰岛素水平的影响，也不受运动和饮食等因素的影响，能够较准确的反映患者过去8-12 w的平均血糖水平。美国糖尿病学会、欧洲糖尿病研究委员会及国际糖尿病协会联合组成的国际专家委员会推荐使用HbA1c作为诊断糖尿病的新指标，HbA1c还是世界卫生组织和许多国家糖尿病协会推荐的糖尿病首选诊断标准。由于HbA1c的检测方法众多，不同实验室间的检测结果可因所用的原理、方法学不同，所测组分及Hb变异体的差异，均可影响实验样本的稳定性、检测结果的准确性及重复性，导致各实验室之间检测结果差异较大，缺乏可比性和溯源性。目前，国际较公认的HbA1c检测标准化参考方法是由国际临床化学联合会（The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）提出的，该方法已经由包括欧洲、日本和美国在内的11家IFCC参考实验室验证。我国也于2011年颁布了《糖化血红蛋白实验室检测指南》，然而HbA1c检测标准化工作仍处于起步阶段，只有积极推动实验室间HbA1c检测标准化和质量管理，才可使HbA1c定量检测的实验报告能达到结果互认，真正成为糖尿病诊断和监测的金标准。

血红蛋白；糖化血红蛋白；糖尿病；标准化；金标准

doi：10.3969/j.issn.1674-7151.2015.01.001

根据国际糖尿病协会统计，2013年全球20～79岁成年人的糖尿病患病率为8.3%，患者人数达3.82亿，到2035年该数字将上升至5.92亿［1］。我国糖尿病的发病率也正呈明显上升趋势，由上海交通大学医学院附属瑞金医院宁光教授团队首次应用国际最新临床诊断标准，在全国范围内完成口服葡萄糖耐量试验结合糖化血红蛋白［即血红蛋白A1c （hemoglobin A1c，HbA1c）］测定以明确诊断2型糖尿病的调查［2］数据表明，2010年中国18岁及以上成年人糖尿病患病率高达11.6%、糖尿病前期率为50.1%。根据研究样本估测，我国成年人中约有1.139亿糖尿病患者及4.934亿糖尿病前期人群。

长期以来，糖尿病的诊断主要依据空腹血糖和口服葡萄糖耐量试验，现在这种状况将面临改变。由美国糖尿病学会（American Diabetes Association，ADA）、欧洲糖尿病研究委员会及国际糖尿病协会联合组成的国际专家委员会推荐使用HbA1c作为糖尿病诊断的新指标，HbA1c还是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和许多国家糖尿病协会推荐的糖尿病首选诊断标准［3-5］。本文就HbA1c的形成机制、检测方法和标准化等方面做一浅析。

1　血红蛋白（hemoglobin，Hb）及其变异体和糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）定义

1.1Hb成人Hb主要由HbA1（95.0%～97.0%，2α，2β）、少量的HbA2（2.5%～3.0%，2α，2δ）和HbF（0.5%～1.0%，2α，2γ）组成。HbA是由2条141个氨基酸组成的αA链和2条146个氨基酸组成的βA链构成的四聚体2αA2βA。HbA中约90%为非 GHb（HbA0），5%～8%为 GHb（HbA1），其中HbA1经色谱分析后又分为HbA1a1、HbA1a2、HbA1b和HbA1c四种成分，HbA1c约占80%，是HbA1的主要成分。

1.2Hb变异体20世纪60年代，Rahbar在筛查人群中可能存在的异常Hb时发现，糖尿病患者体内存在电泳速度非常快的Hb成分，并被认为是一种异常的Hb。次年，Rahbar［6］研究小组证实这种异常Hb在结构上与HbA1c相同。之后的研究报道显示Hb变异体有数百种，大多数起源于Hb的α、β、γ、δ链的点突变。临床最常见的Hb变异体是HbF、HbS和HbC。HbF是胚胎时期的Hb由两条α链和两条γ链组成。出生时，70%的Hb是HbF，6个月后降到5%以下。遗传性HbF持续存在的个体其体内浓度可达到总Hb的30%，而β地中海贫血和镰状细胞病患者体内HbF的浓度占总Hb的2%～20%。HbS变异体有明显的地区、种族差异。在美国，HbS是最常见的Hb变异体，尤其在纯合子镰状细胞病患者体内，有三分之一可检测出HbS。HbC是一种α链异常的Hb，较正常的α链（141个氨基酸）多了31个氨基酸，共172个氨基酸。原因在于α基因的终止密码突变为有意义的密码子而形成异常Hb，由于突变使α链合成延缓，引起α珠蛋白合成障碍性贫血［7］。该病在东南亚和中国南方均有发现［8］。

1．3GHb定义GHb是葡萄糖对HbA的非遗传修饰，是人体血液中葡萄糖与Hb链上的游离氨基酸之间非酶促糖化作用的产物。Hb链上有多个游离氨基酸，其中β链N-末端的缬氨酸氨基暴露于葡萄糖的程度最高，他们以共价键结合形成稳定的复合物，其糖化产物是GHb的主要成分，称为HbA1c［5，9，10］。未经治疗的糖尿病患者血液中葡萄糖浓度很高，多余的葡萄糖糖化血液中的Hb，从而形成HbA1c。

2　HbA1c的形成过程

葡萄糖进入红细胞后，与HbA的β链N末端缬氨酸残基缩合，先形成一种不稳定的 Schiff碱（醛亚胺结构），即前HbA1c，再解离或经Amodori分子重排后形成HbA1c（醛酮结构）。该反应的过程是缓慢而不可逆的，并且由于红细胞内没有分解醛酮的酶，因此HbA1c的形成过程存在于红细胞的整个生命周期中，其形成速度与红细胞内的葡萄糖浓度有关，而与胰岛素水平无关。所以，HbA1c水平只与红细胞寿命和该时期体内血糖的平均浓度有关，不受运动和饮食的影响，能反映过去8-12 w的平均血糖浓度，是目前国际上公认的用于评估糖尿病患者长期血糖状况的理想指标。

3　常用的HbA1c测定方法及评价

到目前为止，有超过30种不同的方法用于定量检测HbA1c［11-13］，其中常用的检测方法及其性能如下。

3．1离子交换层析法基于电荷差异进行分析。葡萄糖与Hb的β链末端Val连接降低了等电点，导致HbA1c带的正电荷比未糖化Hb少，与树脂的附着力小。可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将HbA1c从阳离子交换柱中洗脱下来，再根据每个峰值下的面积来计算HbA1c占总Hb的比例。该方法中Hb变异体会随HbA1c一起被洗脱下来，影响HbA1c值［12］。

3．2亲和层析法基于糖化与非糖化Hb结构不同，凡是糖基化的Hb均可以与硼酸盐结合形成可逆的复合物，未糖化Hb先被洗脱后，再用山梨醇分离复合物，并将全部GHb洗脱出来，检测结果是总GHb，通过换算得出HbA1c的量。但该法对于变异Hb和病理Hb的影响相对其他方法不敏感，易造成检测结果不准确［11］。

3．3免疫法采用单克隆抗体特异识别GHb β链N末端最后4～6个氨基酸组成的抗原表位，在自动生化分析仪上利用抗原、抗体反应的原理进行免疫比浊测定。以GHb为标准，测定HbA1c的含量，再测定Hb的含量，最后计算出HbA1c占总Hb的百分数。该方法具有良好的精密度及与其他方法良好的相关性。但当Hb发生第6位氨基酸变异 （HbS和HbC）时将不会被识别。又因各厂家产品的单抗针对的抗原决定簇不同、亲和力不同等因素将影响检测结果的可比性［12］。

3．4均相酶法其原理是在蛋白酶的作用下，切断GHb的β链N末端的糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成过氧化氢，在过氧化氢的存在下与显色剂产生显色反应，通过测定吸光度值求出HbA1c的百分浓度。此法是近几年才推出的快速、均一的反应体系。该方法精密度好，与高效液相色谱法和免疫法有良好的相关性。但其缺点是也不能识别Hb变异体［14］。

3．5电泳法由法国 Sebia公司推出的 CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING毛细管电泳分析仪，其检测原理是利用不同蛋白分子在pH=9.4的缓冲条件下，仪器自动溶血，并通过毛细管的阳极端吸入进样，然后在高电压条件下，在电渗流和电场力的作用下的泳动速率不同而进行蛋白质分离，属液相电泳。并在毛细管阴极端以波长415 nm直接检测Hb（415 nm是Hb特有的吸收峰，可以准确地对HbA1c以及其他Hb进行定量）。在使用碱性缓冲液条件下，正常和异常（或变异体）Hb按下列顺序检测出来，从阴极到阳极依次为HbA2、HbC、HbE、HbS、HbD、HbF、HbA0、其他Hb以及HbA1c。距阴极端最近的是含糖基最少的HbA1a和HbA1b，处于中间的是HbA1c，距阳极端最近的是Hb的主要成分、未糖化的HbA0和糖化的HbA2，同时其对HbA2的定量检测又可用于β地中海贫血的筛查。该方法是已通过国际临床化学联合会（The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）和美国糖化血红蛋白标准化计划组织（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）认证的HbA1c检测方法［15-17］。

3．6即时检验（point-of-care testing，POCT）国内目前使用较多的有两种方法，一种是利用硼酸亲和原理在颜色反射机上进行HbA1c的快速检测；另一种是基于免疫反应原理在荧光分光光度仪上检测含HbA1c的荧光染料分子的斑点数，换算成HbA1c的百分浓度。POCT检测HbA1c具有便携、快速等优点，但相当一部分POCT方法的精密度尚不能满足临床要求，且对样本中的Hb含量要求有较大限制［18］。

4　HbA1c的检测结果报告和临界值

HbA1c的检测结果将在全球范围内标准化，实验室的结果报告应以传统单位（%HbA1c）报告，并同时报告IFCC的国际单位（mmol/moL），再用NGSP单位换算公式进行换算后共同报告结果［5，13］。NGSP单位换算公式如下

NGSP HbA1c=0.0915（IFCC HbA1c）+2.15%

2009年，国际专家委员会一致同意推荐使用HbA1c诊断糖尿病，并发布了工作报告［3］。2010年，ADA对国际专家委员会的建议给予充分肯定，并正式确定将HbA1c作为糖尿病诊断的标准之一，临界值为HbA1c＞6.5%，HbA1c水平在5.7%～6.4%的患者归为“糖尿病高危人群”。2011年，WHO正式推荐以HbA1c＞6.5%作为诊断糖尿病的标准［4，10］。

5　HbA1c检测的标准化和质量管理

不同实验室间的检测结果可因所用的原理、方法学不同，所测组分（HbA1或HbA1c）的差异，再加上Hb变异体（HbS、HbC、HbE和HbF）的影响，而对实验结果的准确性、重复性，甚至样本的稳定性均有影响，导致各实验室之间结果差异较大，很难具有可比性和溯源性［19］。由于HbA1c测定的准确性直接关系到临床对糖尿病的诊断和疗效评估，因此，对HbA1c检测的标准化和质量管理已受全球关注。

5．1HbA1c检测的国际标准化和质量管理1993年，美国临床化学协会建立的NGSP通过参考实验室网络的样本比对来降低室间差异，要求检测实验室应参加能力比对试验。实验室采用可溯源到糖尿病控制与并发症试验（diabetes control and complication trial，DCCT）参考物质的方法，使报告的结果都能溯源到DCCT的结果。1995年，IFCC成立了HbA1c标准化工作组，旨在研究一个可供追溯的参照系统，研发HbA1c参考物质和参考方法［8，13］。该工作组历时5年的探索，经过多家实验室的努力，于2002年推出了一套HbA1c参考方法，即将待测标本溶血后经胞内蛋白酶酶解，然后应用高效液相色谱串联电喷雾质谱仪或高效液相色谱串联毛细管电泳仪，利用信号比例计算出糖基化的β链N末端六肽片段的比例，从而得出HbA1c在样本中所占的百分比，是检测HbA1c分子浓度的新方法，IFCC推荐的参考方法较NGSP参考方法特异性强，该方法已经由包括欧洲、日本和美国在内的11家IFCC参考实验室验证［11］。2011年，美国生化科学院发布的HbA1c检测在糖尿病诊断和管理中的应用与建议中指出，HbA1c的室内CV＜2%，室间CV＜3.5%，并至少需要做两个水平的质控品。

5．2我国HbA1c检测的标准化和质量管理国内各实验室采用的HbA1c检测试剂多达60余种，甚至很多实验室仍采用非标准化的方法，缺乏相关的参考实验室网络及正确性验证的途径，检测结果的可比性不容乐观，全国范围内的HbA1c检测标准化面临严重挑战［11］。2010年卫生部临检中心HbA1c室间质评不同仪器组内CV为4.54%～21.03%［20］。2011年北京市临检中心HbA1c检测室间质评的结果显示，相同仪器组内CV基本在4%以下，虽显示了很好的精密度，但是不同仪器组内CV仍高达15.8%，检测结果的可比性差，无法达到HbA1c检测结果的互认［20］。2010年3月，中国HbA1c教育计划在北京启动，该计划是国内首次由内分泌和检验医学界专家共同参与的大型学术活动，旨在提高HbA1c检测的标准化，以及在糖尿病管理中的地位，以加强临床医师对HbA1c的认识和重视［20］。上海临床检验中心采用 IFCC HbA1c一级参考方法，于2010年完善并获候选参考实验室资格，2011年考核合格，2011年11月1日正式成为包括欧美日12家实验室之后的第13家运行一级参考方法的参考实验室网络中的一员，为中国HbA1c标准化工作走上一个新的台阶［18］。

HbA1c因其在体内存在时间长，水平较稳定，不受运动或饮食影响的特点，已逐渐成为新的糖尿病诊断和监测指标。目前，由卫生部临床检验中心、国家食品药品监督管理总局医疗器械检验所和糖尿病学专家根据我国HbA1c检测现状，结合国内外相关研究进展，共同制定HbA1c实验室检测指南［5］，于2011年经卫生部组织专家讨论并已通过。然而，HbA1c测定标准化工作在我国还处于起步阶段，任重而道远。希望通过我国HbA1c实验室检测指南的出台和贯彻落实，推动HbA1c检测标准化和质量管理更加深入开展，使HbA1c定量检测的实验报告能达到结果互认，真正成为糖尿病诊断和监测的金标准。

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（本文编辑：杨军）

（2014-03-27）