酶解辅助乙醇提取牡丹种皮中的木犀草素1)

孟庆焕 祖元刚 王化

(森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040) (黑龙江省科学院自然与生态研究所)

王洪政 路祺 李平 吴薇薇 钟晨 段喜华

(森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学)) (哈尔滨市第三中学) (森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学))

2011 年，牡丹籽油被原卫生部列为新资源食品［1-2］。牡丹种皮是在牡丹籽油生产过程中的废弃物，一般作为垃圾直接丢弃，这样不仅影响环境卫生，也会造成自然资源的严重浪费，直接影响牡丹籽的高值化利用。前期研究发现牡丹种皮中含有黄酮类化合物，并且具有良好的清除自由基作用［3-5］。进一步对牡丹种皮黄酮类化合物进行研究分析，发现了一种重要的活性成分——木犀草素。木犀草素具有抑菌、抗氧化、降血脂、降血压、抗肿瘤等多种生物活性，临床常用于止咳、祛痰、消炎等［6-7］。目前对于木犀草素的提取方法主要采用热回流萃取法、微波辅助法、超声波辅助法等这些方法都有各自的优缺点［8-9］。但针对提取木犀草素的原料牡丹种皮来说若使用上述方法，存在一个共同缺点，即粉碎牡丹种皮过程中产生大量粉尘，会严重影响操作人员的身体健康。所以本研究采用生物酶辅助乙醇匀浆法优化木犀草素提取工艺，一方面可以直接将物料置于匀浆机中，与提取溶剂在匀浆装置中混合均匀，通过机械及溶液之间的力的剪切作用将物料撕碎，使物料破碎和有效成分的提取同步进行，达到种皮中目的活性物质快速和强化提取。另一方面，生物酶可以将细胞壁的组成成分水解或是降解，破坏细胞壁的结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬于溶剂中，从而达到提高木犀草素提取率的目的［10-11］。目前该方法在国内外关于木犀草素的提取研究方面未见报道，本实验以木犀草素的提取率为参考指标，探求酶法辅助乙醇提取木犀草素的最佳工艺条件，为牡丹种皮中的木犀草素提取提供一种新的高效的工艺方法。

1 材料与方法

1．1 材料

牡丹成熟干燥的种子，经脱壳机去皮，收集种皮洗净后于干燥箱中60 ℃烘干过夜，粉碎过40 目筛备用。木犀草素对照品(中国药品生物制品鉴定所)、纤维素酶R-10(酶活力10 000 U/g，Amresco，美国)、果胶酶(酶活力500 U/mg，Amresco，美国)，甲醇为色谱纯，超纯水自制，其他试剂均为分析纯。

717 型自动进样高效液相色谱仪，包括1525 二元泵和2487 型紫外光检测器(美国WATERS 公司);Mill-Q 去离子水制备系统(美国Millipore 公司);美国迪马色谱柱(4．6 mm×250 mm，5 μm);3K-30 超速离心机(美国Sigma 公司)。

1．2 方法

1．2．1 HPLC 测定条件

HPLC 液相条件。色谱柱:Diamonsil C18(250 mm×4．6 mm，5 μm);流速1 mL·min-1，进样量10 μL。流动相为V(甲醇)∶V(0．4%磷酸水溶液)=52 ∶48;检测波长360 nm。

标准曲线的制作。配制标准品，准确称取木犀草素对照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，使之成为质量浓度1 g·L-1的标准储备液，再依次稀释成0．5、0．25、0．125、0．062 5、0．031 25 g·L-1不同质量浓度的标准溶液待测。每样重复3 次，峰面积取平均值，以标准品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，得木犀草素对照品回归方程y=38 813 650．58x+92 733．00(R2=0．999)，表明木犀草素在0．031 25 ～0．5 g·L-1质量浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。

1．2．2 乙醇提取工艺单因素实验

乙醇提取溶剂体积分数的筛选，准确称取5．00 g牡丹种皮，按m(牡丹种皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL混合均匀后，匀浆3 min 提取一次的条件下，用体积分数分别为30%、50%、60%、70%、80%和95%乙醇溶液提取牡丹种皮中木犀草素，比较提取率差异，讨论乙醇质量分数对提取率的影响。

料液比的筛选，准确称取5．00 g 牡丹种皮，加入体积分数为80%的乙醇溶液，匀浆，混合均匀后，匀浆3 min 提取一次的条件下，按m(牡丹种皮)∶V(乙醇)为1 g ∶6 mL、1 g ∶8 mL、1 g ∶10 mL、1 g ∶12 mL、1 g ∶15 mL 和1 g ∶20 mL，提取牡丹种皮中木犀草素，比较提取率的差异，讨论牡丹种皮样品与乙醇溶液的料液比对提取率的影响。

匀浆时间的筛选，准确称取5．00 g 牡丹种皮，按m(牡丹种皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL 加入80%乙醇溶液，匀浆一次，提取时间分别为1、2、3、4、6 和8 min，提取牡丹种皮中木犀草素，比较提取率，讨论匀浆时间对提取率的影响。

提取次数的筛选，准确称取5．00 g 牡丹种皮，按m(牡丹种皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL 加入乙醇溶液，混合均匀后，匀浆6 min，用体积分数为80%的乙醇溶液提取牡丹种皮中木犀草素，提取次数分别设为1、2、3 和4 次，比较提取率差异，讨论匀浆提取次数对牡丹种皮中木犀草素提取率的影响。

1．2．3 酶解处理单因素实验

纤维素酶和果胶酶种类和质量浓度的筛选。准确称取7 份1 g 牡丹种皮，在45 ℃、pH 值4．5 和孵育180 min 条件下进行酶解，每份牡丹种皮中加入HAc-NaAc 酶缓冲液2 mL，分别为0．1 g·L-1纤维素酶、0．2 g·L-1纤维素酶、0．3 g·L-1纤维素酶、0．5 g·L-1纤维素酶、0．01 g·L-1果胶酶、0．05 g·L-1果胶酶和0．1 g·L-1果胶酶。取出后在90 ℃下灭活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照匀浆优化条件进行匀浆后，测定牡丹种皮中木犀草素的提取率。

孵育时间的筛选。准确称取1 g 牡丹种皮4份，加入含0．05 g·L-1果胶酶的HAc-NaAc 酶缓冲液2 mL，在45 ℃、pH 值4．5 条件下进行酶解，酶解孵育时间分别为90、120、150、180 min。取出后在90℃下灭活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照匀浆优化条件进行匀浆后，测定牡丹种皮中木犀草素的提取率。

孵育温度的筛选。准确称取1 g 牡丹种皮4份，加入含0．05 g·L-1果胶酶的HAc-NaAc 酶缓冲液2 mL，在pH 值4．5、时间150 min 条件下进行酶解、温度分别为40、45、50、55 ℃。取出后在90 ℃下灭活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照匀浆优化条件进行匀浆后，测定牡丹种皮中木犀草素的提取率。

孵育pH 的筛选。准确称取1 g 牡丹种皮4 份，加入含0．05 g·L-1果胶酶的HAc-NaAc 酶缓冲液2 mL，在温度为45 ℃、时间150 min 条件下进行酶解，pH 值分别为3．5、4．0、4．5 和5．0。取出后在90 ℃下灭活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照匀浆优化条件进行匀浆后，测定牡丹种皮中木犀草素的提取率。

1．2．4 样品测定溶液制备

将所得牡丹种皮木犀草素提取液，放入1．5 mL离心管中，置于离心机10 000 r·min-1离心10 min后，按照上述HPLC 液相条件，测定木犀草素提取率。

2 结果与分析

2．1 乙醇提取单因素实验

由表1 可以看出:随着乙醇体积分数升高，木犀草素的提取率也增加，在达到80%时，提取率最高;此后随乙醇体积分数升高，提取率反而下降。而随着料液比增加、匀浆时间延长和提取次数的增多，木犀草素提取率呈现先增加后基本保持平稳的趋势。

2．2 乙醇提取木犀草素正交试验

在单因素实验的基础上，按照尽量减少实验次数和寻求设计最优的原则，选择乙醇体积分数、料液比、匀浆时间和提取次数作为因素，每个因素各取3 水平。正交试验方案(L9(34))及结果见表2 和表3。

表1 乙醇提取单因素实验结果

表2 乙醇提取木犀草素正交试验因素水平

表3 乙醇提取木犀草素正交试验结果

由表3 极差分析结果可以看出，对木犀草素提取率影响最大的是乙醇体积分数，影响最少的因素是匀浆时间，各因素影响的主次顺序为:乙醇体积分数、料液比、提取次数、匀浆时间。由k 值可以得到最佳组合:A2B2C1D2，即乙醇质量分数80%、m(牡丹种皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL、匀浆时间为4 min和提取2 次。在最优乙醇提取条件下，经过验证实验可得木犀草素最高提取率为0．754 mg·g-1。

2．3 酶解辅助乙醇提取工艺单因素实验

由表4 所示，经过酶解孵育后，牡丹种皮中木犀草素提取率呈显著增加趋势。木犀草素提取率在0．1 g·L-1纤维素酶孵育后增加缓慢，在0．05、0．1 g·L-1的果胶酶孵育后的牡丹种皮中木犀草素提取率增加明显。随着酶孵育时间的延长，木犀草素提取率呈增加趋势;而随着孵育温度和孵育pH 值升高，木犀草素提取率出现了拐点，呈现先升高后降低的趋势。根据上述实验结果，选取有意义的水平进行下一步实验。选择纤维素酶0．5 g·L-1、果胶酶0．05、0．1 g·L-1，孵育时间120、150、180 min，孵育温度40、45、50 ℃，孵育pH 值4、4．5、5，进行下一步的正交试验。

表4 酶解辅助乙醇提取工艺单因素结果

2．4 酶辅助乙醇提取木犀草素优化工艺

在前期乙醇匀浆优化工艺参数和酶解辅助提取单因素实验基础上，对酶解辅助乙醇提取木犀草素工艺进行了正交试验优化(L9(34))，试验设计与结果见表5 和表6。

表5 酶辅助乙醇提取木犀草素正交试验因素和水平

影响木犀草素提取率的各因素主次顺序是:酶液质量浓度、孵育温度、孵育时间、孵育pH 值。由极差分析得最佳条件组合为:A2B3C2D2，即果胶酶质量浓度为0．05 g·L-1，酶解孵育时间为180 min，孵育温度45 ℃、孵育pH 值为4．5。

表6 酶解辅助乙醇提取木犀草素正交试验结果

2．5 最佳工艺的验证实验

对正交试验中酶解辅助乙醇匀浆提取木犀草素的最佳工艺条件进行验证实验:准确称取1 g 牡丹种皮3 份，加入含0．05 g·L-1果胶酶的HAc-NaAc酶缓冲液2 mL，在温度为45 ℃、pH 值4．5 条件下进行酶解孵育180 min。在90 ℃下灭活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 匀浆4 min，提取2 次，测定牡丹种皮中木犀草素提取率平均值为3．241 mg·g-1，均高于单因素实验和正交试验结果，表明此工艺可以有效提高牡丹种皮中木犀草素的提取率。

3 结束语

复合酶解辅助乙醇提取木犀草素的工艺参数为:酶解孵育温度45 ℃、果胶酶0．05 g·L-1、酶解孵育时间180 min、酶解孵育pH 值4．5、乙醇体积分数80%、m(牡丹种皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL、匀浆时间4 min、提取2 次，在此最优条件下所得木犀草素提取率为3．241 mg·g-1，相较于乙醇提取法所得木犀草素提取率0．754 mg·g-1，升高4．3 倍。

经过酶孵育处理的牡丹种皮中木犀草素提取率显著提高，并且果胶酶处理后所得木犀草素提取率高于纤维素酶，这与牡丹种皮的物质组成有密切关系。纤维素酶主要是降解细胞壁中的纤维素，而果胶酶主要是降解细胞壁和胞间质中的果胶。通过本实验分析推断，牡丹种皮中果胶的含量比较高，因此使用果胶酶可以使牡丹种皮中的有效成分充分溶出，达到强化提取的作用，最终获得了一种提取木犀草素的最佳工艺。

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