银杏叶总黄酮的负压沸腾提取工艺1)

周昊 王成章 叶建中 陈虹霞 陶冉 张宇思

(中国林业科学研究院林产化学工业研究所，南京，210042)

银杏(Ginkgo biloba L)又名白果、公孙树等，为最古老的中生代孑遗植物。银杏叶中含有丰富的黄酮类化合物，具有改善心脑血管循环、抗过敏、抗病毒、抗癌、抗衰老及降低胆固醇等作用［1-3］。以银杏叶总黄酮为原料的加工产品已经广泛应用于医药业、化妆品、食品制造业［4-5］。

银杏叶总黄酮为热敏性活性物，在光、热和酶作用下容易分解，产生次生代谢产物［6］。国内银杏叶提取物生产企业大多采用传统的热回流提取，以热浸式和渗漉式为主，生产工艺存在最突出的问题是:时间长，提取效率低;对于总黄酮产生破坏较多;提取液质量不高，总黄酮含量低，杂质多，造成后续工艺提纯复杂，如浓缩、醇沉、水沉、过滤、离心、吸附等，从而造成了生产周期长，能耗和成本大大上升，且资源浪费严重［7-8］。负压提取法通过在常规提取器上引入真空系统，以抽气的形式激发的微小气泡(空化核)在瞬间溃灭，使其周围产生强烈的空化效应和机械效应加速原料组织中有效成分的溶出，从而实现了低温、快速提取，可以有效防止提取过程中热不稳定物质的分解，是一种新型的提取方法［9］。负压沸腾提取与响应曲面设计相结合在银杏叶中总黄酮的提取中的应用尚未见报道，本实验采用负压沸腾技术提取银杏黄酮等热敏性成分，从而为银杏叶的提取探索一条更为有效的工艺途径。

1 材料与方法

岛津LC-20AT 型高效液相色谱仪;岛津SPDM20A 型二极管阵列检测器。银杏叶(银杏黄酮质量分数为9．80%)，于2012 年8 月采自邳州银杏叶生产基地港上镇，采集后避光自然阴干;槲皮素、山萘素、异鼠李素对照品纯度均为98%以上;甲醇为色谱纯;其它化学试剂均为分析纯。

1．1 HPLC 测定方法

色谱条件:色谱柱C18ODS(4．6 mm×200 mm，5 μm)，流动相:V(甲醇)∶V(水)= 50 ∶50(水中含0．4%的磷酸)，检测波长360 nm，流速1 mL/min。

标准曲线绘制:分别精密称取槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品适量，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0．854、0．562、0．259 g/L 的混合对照品溶液;依次精密量取混合对照品溶液0．05、0．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．40 和0．50 mL 置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀后分别取10 μL 进样，进行色谱分析。

样品测定:精密称取银杏叶干粉经提取、浓缩、干燥后制得的银杏提取物粉末0．1 g，置于50 mL 圆底烧瓶中，加入30 mL(V(甲醇)∶V(25%盐酸)=4 ∶1)混合液，摇匀溶解，置于水浴(85 ℃)中加热回流30 min，然后迅速冷却至室温，转移至50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得样品溶液。

1．2 负压沸腾提取银杏黄酮的单因素试验

提取溶剂的选择:常压下，分别称取10．0 g 银杏叶干粉原料，按V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)=10 mL ∶1 g 加入不同溶剂(水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液)，提取时间2 h，提取温度80 ℃，测定不同提取溶剂对银杏叶总黄酮提取率的影响。

不同提取压力对应的沸腾温度:分别称取银杏叶干粉原料10．0 g，按V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 10 mL ∶1 g 加入60%乙醇溶液，分别采用不同的提取压力-0．1、-0．09、-0．08、-0．07、-0．06、-0．05和-0．04 MPa，测定不同提取压力下溶液开始沸腾时的温度。

提取压力的选择:分别称取银杏叶干粉原料10．0 g，60%乙醇为提取溶剂，在V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 10 mL ∶1 g、提取时间为120 min 条件下负压提取2 次，考察在不同提取压力如-0．1、-0．09、-0．08、-0．07、-0．06、-0．05 和-0．04 MPa 对银杏叶总黄酮提取率的影响。

提取时间的选择:分别称取银杏叶干粉原料10 g，60%乙醇为提取溶剂，在提取压力为-0．08 MPa、V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 10 mL ∶1 g 的条件下负压提取2 次，考察在不同提取时间如15、30、45、60、90、120、150 和180 min 对银杏叶总黄酮提取率的影响。

液料比的选择:分别称取银杏叶干粉原料10．0 g，60%乙醇为提取溶剂，在提取压力为-0．08 MPa、提取时间为60 min 的条件下负压提取2 次，考察在不同料液比为4、6、8、10、12、15 和20 mL/g 时对银杏叶总黄酮提取率的影响。

提取次数的选择:分别称取银杏叶干粉原料10．0 g，60%乙醇为提取溶剂，在提取压力为-0．08 MPa、V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 10 mL ∶1 g、提取时间为60 min 的条件下负压提取，考察在不同提取次数如1、2、3、4、5 对银杏叶总黄酮提取率的影响。

1．3 负压沸腾提取银杏黄酮的响应面优化

根据Box-Behnken 试验设计原理，在单因素试验结果基础上，选取3 个主要试验因素和3 个水平，对提取工艺进行响应面分析试验，3 个主要因素为提取压力、V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)和提取时间。

1．4 负压沸腾提取与传统提取的比较试验

分别称取银杏叶干粉原料10．0 g，负压沸腾提取工艺在优化的最佳工艺条件下进行;传统提取工艺是按V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 10 mL ∶1 g 加入60%乙醇水溶液，80 ℃下常压热回流提取2 h，提取2 次，提取液过滤后合并。

2 结果与分析

2．1 银杏黄酮的HPLC 测定结果

线性关系考察结果得出槲皮素标准曲线方程为y=28 665x-22 686，r=0．999 6，表明槲皮素在8．54 ～85．4 mg/L 质量浓度内与吸光度有良好的线性关系;山奈素标准曲线方程为y=30 942x+22 770，r=0．999 8，表明山奈素在5．62～56．2 mg/L 质量浓度内与吸光度有良好的线性关系;异鼠李素标准曲线方程为y=36 469x-33 875，r=0．999 6，表明异鼠李素在2．59～25．9 mg/L 质量浓度内与吸光度有良好的线性关系。

由图1 可知，银杏叶总黄酮样品与标准品出峰时间基本一致，经负压提取得到的银杏叶总黄酮在上述的色谱条件下，银杏叶总黄酮的HPLC 峰分离效果较好，其峰在一定范围内没有其他峰的干扰。

图1 银杏黄酮标准品及样品的HPLC 图谱

2．2 单因素试验

提取溶剂的优选:由表1 可知，随着乙醇体积分数的升高，总黄酮苷的提取率也随之升高，当体积分数为60%提取率达到最大为93．38%。但随着乙醇体积分数的提高，其提取率呈下降趋势，其原因是银杏黄酮易溶于含水乙醇，在一定溶液体积范围内，当乙醇体积分数达到60%以后，银杏叶总黄酮溶解度最大，乙醇体积分数加大反而溶解度下降，因此，银杏叶总黄酮的最佳提取溶剂为60%乙醇溶液。

此外，这也可能与银杏叶的组分以及银杏叶总黄酮的物理性质有关，银杏叶总黄酮易溶于乙醇水，银杏叶总黄酮与植物组织中的蛋白质、生物碱、多糖等物质发生复合，乙醇与水的混合液可打断银杏叶总黄酮物质与蛋白质、多糖等物质的结合键，有利于银杏叶总黄酮的提取;但乙醇体积分数过高，会使银杏叶中细胞失水而造成纤维间紧缩，影响银杏叶总黄酮的渗出［10］。

不同提取压力对应的沸腾温度:由于溶媒的沸点是随外界大气压的降低而降低的，所以在负压的条件下，就可以在较低的温度下使溶液处于沸腾状态下而进行提取，这样既不致于使植物中热敏性物质遭受高温煎煮的破坏，又不会由于高温煎煮导致大量容易水解产生大分子杂质如淀粉、糊精、蛋白质、色素、鞣酸、粘液质等［11］。

试验测得压力为-0．1 MPa 时对应的沸腾温度为41～44 ℃;-0．09 MPa 时对应的沸腾温度为46～51 ℃;-0．08 MPa 时对应的沸腾温度为50 ～55 ℃;-0．07 MPa 时对应的沸腾温度为60 ～65 ℃;-0．06 MPa 时对应的沸腾温度为70 ～75 ℃;-0．05 MPa 时对应的沸腾温度为80～85 ℃;-0．04 MPa 时对应的沸腾温度为86～90 ℃。

提取压力的影响:由表1 可知，随着提取负压的升高，银杏叶总黄酮的提取率先升高后降低，当提取压力在-0．08 MPa 时，提取率达到最大。其原因可能是提取负压的上升，使得提取温度降低，银杏叶总黄酮在溶液中扩散速度变慢，提取率会有所降低。故提取压力优选为-0．08 MPa。

提取时间的影响:由表1 可知，随着提取时间的增加，银杏叶总黄酮的提取率呈上升趋势，60 min 时达到最大值;随着时间的延长提取率会略有下降，这表明银杏叶总黄酮的溶出量与时间密切相关，提取时间过短可能使提取不够充分，但提取时间过长又可能引起银杏叶总黄酮结构的变化进而使其含量降低。

料液比对提取率的影响:由表1 可知，随着乙醇溶液体积量的增加，银杏叶总黄酮的提取率呈现上升趋势，在V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)=10 mL ∶1 g的条件下银杏叶总黄酮的提取率达到93．26%，继续增加料液比其提取率变化不大;其原因可能是随着料液量增加，银杏叶总黄酮溶解量增加，使其提取率升高;但是银杏叶总黄酮在水的体积量较大的情况下容易水解，并且随着溶液总体积量增大，水的体积量也相应的增加最终使银杏叶总黄酮水解程度加剧，从而影响银杏叶总黄酮提取率。因此，最优选择为V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 10 mL ∶1 g。

提取次数的影响:银杏叶总黄酮在负压提取的条件下，提取1 次，提取率为73．34%，提取2 次，提取率达到96．79%。2 次提取几乎把银杏叶总黄酮提取完全。因此在负压提取条件下，从生产成本及可操作性等方面综合考虑选择2 次提取较为合适。

表1 银杏叶总黄酮负压提取工艺的单因素试验结果

2．3 响应面分析法优化

2．3．1 回归模型的建立和显著性检验

利用Design-expert7．1．6，采用Box-Behnken 模型以银杏总黄酮提取率为指标，选取提取压力(A)、V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)(B)、提取时间(C)设计3 因素3 水平共17 个试验，其中包括13 个析因试验和4 个检验误差的零点试验，试验结果见表2，方差分析见表3。

通过对表2 数据进行回归分析，得到二次多项回归方程为:Y=92．93+2．22A+0．18B+1．55C-1．13AB-1．14AC+1．57BC-3．56A2-2．93B2-1．57C2。从表3 可以看出，模型的F＜0．000 1，表明该模型非常显著;信噪比=16．697，说明该模型可用于预测;修正可决系数=94．92%，表明总变异中仅有5．08%不能用该模型解释;可决系数=97．78%，表明银杏叶总黄酮提取率的预测值与实际值之间具有较好的拟合度。失拟项的F 值为0．053，系统显示为不显著。也说明使用该方程进行拟合的效果较好，因此该模型可用于分析、预测银杏叶总黄酮的实际提取率。

表2 银杏叶总黄酮负压提取工艺的响应面分析试验结果

另外从表3 还可以看出，一次项中A 和C 的回归系数极显著，说明提取压力和时间对银杏叶总黄酮提取率有极显著影响;而B 的回归系数不显著，即V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)对响应值没有显著影响。交互项AB 和AC 的偏回归系数显著，即提取压力和V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)、提取压力和时间的交互项对银杏叶总黄酮提取率有显著影响。交互项BC 的偏回归系数极显著，说明V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)和时间的交互项对银杏叶总黄酮提取率有极显著影响;二次项中A2、B2、C2的偏回归系数达到极显著水平。

表3 回归模型方差分析

2．3．2 响应曲面分析

根据回归方程，做出响应面和等高线，考察拟合响应面的形状，分析提取压力、V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)和提取时间对银杏叶总黄酮提取率的影响，如图2 所示。等高线的形状可反应交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图3 中可以看出，各因素间的交互作用显著。响应曲面可较为直观地看出各因素对银杏叶总黄酮提取率的影响，曲线越陡峭，表明该因素对提取率的影响越大，由图2 可以看出，提取压力和提取时间对银杏叶总黄酮提取率的影响最显著，表现为在各图中曲面较陡，而V(60%乙醇):m(银杏叶干粉)的影响不显著，表现为曲线较平滑，这也符合表3 的方差分析结果。

图2 各因素之间的响应曲面及等高线图

2．3．3 最佳提取工艺的确定及模型的验证

由分析软件可直接得出最优提取工艺为:提取压力-0．082 18 MPa，提取时间74．13 min，V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 11．16 mL ∶1 g，所得银杏叶总黄酮提取率为93．55%，但从试验的可行性考虑，将最优工艺调整为:提取压力-0．08 MPa，提取时间70 min，V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)=10 mL ∶1 g。为了验证响应面法所得结果的准确性，并结合实际提取银杏黄酮，重复试验3 次，所得的银杏叶总黄酮提取率分别为93．06，93．48 和93．72，平均值为93．42%，二者的误差小于0．5%。说明由响应面法所得的银杏叶总黄酮提取条件与实际试验结果相近，有很好的参考作用。

2．4 银杏黄酮的负压沸腾提取与传统提取工艺的比较

以银杏叶总黄酮提取率和干膏的得率为考察因素，对银杏叶总黄酮的负压沸腾提取工艺与传统的常压回流提取工艺进行了比较，结果见表4，结果表明负压沸腾提取法的提取率要高于传统的常压回流提取法，且负压沸腾提取工艺所得的干膏质量小，杂质含量减少，负压提取时间也较短，较常压提取时间减少了42%，大大降低生产成本。

表4 负压与常压回流提取法比较

3 结论与讨论

在单因素试验的基础上，采用RSA 优化了银杏黄酮的负压沸腾提取工艺参数，建立了回归模型方程，该模型回归极显著，说明该方程对试验拟合较好。通过响应面分析得到优化的提取工艺条件是:以60%乙醇溶液为提取溶剂，提取压力-0．08 MPa，提取时间70 min，提取温度50 ℃，V(60%乙醇)∶m(银杏叶干粉)= 10 mL ∶1 g，提取2 次。该条件下银杏叶总黄酮提取率的预测值为93．55%，验证值为93．42%，两者十分接近，说明响应值的试验值与回归方程预测值吻合良好，优化结果可信，具有实用价值。

与传统的高温热回流提取方法相比，采用负压沸腾法提取银杏叶中总黄酮，不仅提取温度低为50 ℃，保证银杏黄酮等热敏性成分不被破坏，且提取时间大大缩短了42%，提取率大大提高了13%，提取液中黄酮含量提高了65．90%，明显好于传统方法，优势明显。因此该方法可为工业化提取银杏黄酮提供借鉴。

［1］ 耿秀芳，庞秀英，李桂芝．银杏叶总黄酮近期研究进展［J］．中国中药杂志，2003，28(6):488-490．

［2］ 田季雨，刘澎涛，李斌．银杏叶提取物化学成分及药理活性研究进展［J］．国外医学:中医中药分册，2004，26(3):142-145．

［3］ 马盼香，方成根，连渝平．银杏叶制剂研究的现状与展望［J］．现代中西医结合杂志，2003，12(22):2486-2487．

［4］ 陈西娟，王成章，叶建中．银杏叶化学成分及其应用研究进展［J］．生物质化学工程，2008，42(4):57-62．

［5］ 杜鹏，赵莉．银杏叶及其制剂的研究开发进展［J］．西北药学杂志，2003，18(2):92-93．

［6］ 周统建，曹福亮，汪贵斌，等．银杏树中黄酮类化合物分布规律研究［J］．林产化学与工业，2009，29(6):78-80．

［7］ 胡敏，张声华．银杏黄酮苷的不同提取精制方法比较［J］．武汉大学学报:自然科学版，1998，144(2):255-258．

［8］ 张玉祥，李宗伟．银杏叶有效成分的提取工艺进展［J］．时珍国医国药，2006，17(6):1076-1077．

［9］ 徐连明，徐桂红，王振中，等．金银花减压提取工艺研究［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(5):31-33．

［10］ 张春秀，胡小玲，卢锦花，等．银杏叶黄酮类化合物的提取分离Ⅰ:银杏黄酮化合物的提取［J］．化学研究与应用，2001，13(4):454-456．

［11］ 韩丽，韦娟，周子渝，等．栀子减压提取工艺实验研究［J］．中成药，2011，33(1):160-162．