核黄素对盐胁迫下杜梨叶片抗氧化系统的影响

韩金龙， 李 慧， 蔺 经， 杨青松， 常有宏

(1.江苏省农业科学院园艺研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京210014; 2.南京农业大学园艺学

院，江苏 南京210095)

土壤盐渍化是影响农作物生产的主要因素之一［1］。目前中国盐渍化土地面积不断扩大，给农业生产造成了巨大的经济损失。盐胁迫下，植物细胞膜结构和功能发生变化，细胞内Na+过量积累，导致渗透胁迫、离子毒害、离子不平衡或营养缺乏［2］，伤害细胞中的抗氧化系统，影响植物的正常生长发育。为更好地利用盐渍地资源，缓解土壤盐渍化问题，通过施加外源缓解剂以提高植物抗盐性已越来越受到人们的重视。研究发现施用外源赤霉素( GA3)［3］、油菜素内酯( EBR)［4］、5-氨 基 酮 戊 酸( ALA)［5］、水 杨 酸( SA)［6］、氯化钙［3］等均能提高植物的耐盐性，这一调控过程通常与植株叶片中抗氧化酶活性上升有关。

核黄素( Riboflavin，Rib) 又称维生素B2( Vitamin B2) ，是一种天然水溶性的B 族维生素。核黄素及其衍生物FMN 和FAD 是植物光合作用、能量生成和氧化还原代谢不可或缺的组成部分［7］。应用核黄素可以增强植物对病原菌的抗性、提高耐旱及抗涝能力，这可能与其促进生理代谢过程，诱发细胞中抗氧化物质的合成有关。在逆境条件下，植物体内存在重新分配核黄素的机制来调控环境胁迫反应［8-13］。然而，目前尚无应用核黄素提高植物耐盐能力的报道。

梨是中国重要的果树，土壤盐渍化程度及面积的进一步扩展严重限制其生产［14-16］。嫁接为梨树的主要繁殖方式，砧木的抗性对嫁接苗的适应能力至关重要。提高砧木的耐盐性是解决梨树耐盐碱的关键，杜梨( Pyrus betulaefolia Bunge) 原产中国，以其为嫁接砧木，能够改善梨树的耐盐性［17-18］。在盐胁迫条件下，该物种通过减少Na+在根中积累及向地上部运输来适应逆境［18-20］，但植株叶片仍会受到氧化伤害［21］。本试验通过研究不同浓度的核黄素对盐胁迫下杜梨叶片活性氧产生、抗氧化酶活性和抗氧化物质含量的影响，探讨通过施加核黄素缓解盐胁迫产生氧化伤害的可能性，旨在为核黄素应用于生产实践应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料培养和处理

杜梨种子经1%次氯酸钠消毒后，播种于培养皿湿润无菌滤纸上。待胚根长至1 cm 时，将幼苗移植到光照培养箱的水培系统中( 培养液为Hoagland营养液，pH=5.8) ，用通气泵补充空气，每3 d 更换1 次培养液。培养条件如下: 光照周期16 h 光照/8 h 黑暗，光照度300 μmol/( m2·s) ，培养温度23 ～25 ℃，空气相对湿度60% ～70 %。当植株8 叶1心大小时，选择长势一致的健壮幼苗进行处理，在含200 mmol/L NaCl 的Hoagland 营养液中添加100 mmol/L的核黄素母液，使其在水培系统中的浓度达到0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 和100 μmol/L。以生长在不含NaCl 和核黄素的Hoagland 营养液中的植株为对照。每个处理设3 次重复，处理3 d 后收集植株顶部下第3、4 叶用于各生理指标的测定。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 活性氧和丙二醛含量 过氧化氢( H2O2) 含量测定参照Patterson 等［22］的方法，新鲜叶片用2 ml预冷丙酮提取后，经5 %硫酸钛处理所生成的氧化物-钛复合物黄色沉淀，再用2 mol/L H2SO4溶解，在415 nm 波长下比色测定，通过标准曲线计算叶片中H2O2含量。采用羟胺氧化法测定超氧阴离子产生速率［23］。采用硫代巴比妥酸( TBA) 法测定丙二醛( MDA) 含量［24］。

1.2.2 抗氧化酶活性 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法［25］;超氧化物歧化酶( SOD) 活性测定采用氮蓝四唑(Nitroblue tretrazolium chloride，NBT)光氧化还原法，以抑制NBT 光氧化还原50% 的酶量为1 个酶活性单位［26］;过氧化物酶( POD) 活性测定采用愈创木酚法［26］，以1 min 内OD470值变化0.01 为1 个酶活性单位;过氧化氢酶(CAT) 活性测定参照文献［27］的方法，以1 min 内OD240值变化0.1 为1 个酶活性单位;谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定采用紫外分光光度计法，以340 nm 处吸光值变化计算GR 活性［28］;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定参考黄爱缨等［29］的方法，以1 mg 蛋白质1 min 使反应体系中GSH 浓度降低1 μmol/L为1 个活性单位;抗坏血酸过氧化物酶( APX)活性测定参照Nakano 等［30］的方法测定，以1 min 内OD290值变化0.1 为1 个酶活性单位。

1.2.3 抗氧化物质含量 总谷胱甘肽( Glutathione，GSH) 含量测定采用5，5-二巯基-2-硝基苯酸(5，5-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB) 法［31］; 抗坏血酸( Ascorbic acid，AsA) 含量测定采用分光光度法，在红菲咯啉存在的条件下，AsA 所还原的亚铁离子与其反应形成红色螯合物，通过测定OD534值计算AsA 含量［32］。

1.3 数据分析

采用Microsoft Office Excel 2007 整理数据和绘制图表。用SPSS16.0 统计分析软件进行单因素方差分析( One-way ANOVA) ，并用最小显著差数法( LSD 法) 进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 核黄素对盐胁迫下杜梨叶片活性氧和MDA含量的影响

MDA 是膜脂过氧化作用的主要产物之一，其含量的高低是反映细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标［33］，而和H2O2是诱发细胞膜脂过氧化的重要因子。在盐胁迫(200 μmol/L NaCl)处理3 d 后，杜梨叶片中超氧阴离子的产生速率是对照的2.13 倍，H2O2和MDA 含量分别是对照的2.24 和1.64 倍( 表1) ，意味着植株叶片细胞活性氧代谢系统失去平衡，发生膜脂过氧化。施加5 ～100 μmol/L核黄素( Rib) 后，的产生速率、H2O2和MDA 含量随着Rib 浓度的增加呈现先下降后升高的趋势。当Rib 浓度为5 ～10 μmol/L时，的产生速率和H2O2含量较盐胁迫处理显著降低( 分别降低了44.3% ～55.2%和44.6% ～51.4%) ，MDA 含量亦显著降低( 降低了9.5% ～24.0%) ，且10 μmol/L Rib处理组中，上述3 个指标最低( 表1) 。然而，当Rib浓度为50 ～100 μmol/L时，反而会刺激活性氧的积累(O2·－产生速率和H2O2含量增加) ，加剧膜质过氧化( MDA 积累) ( 表1) 。

2.2 核黄素对盐胁迫下杜梨叶片抗氧化酶活性的影响

由表2 可知，盐胁迫( 200 μmol/L NaCl) 处理3 d 后，杜梨叶片中超氧化物歧化酶( SOD) 活性显著降低( 仅为对照的60.4 %) ，过氧化物酶( POD) 、过氧化氢酶( CAT) 、谷胱甘肽还原酶( GR) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 、抗坏血酸过氧化物酶( APX)活性均有不同程度升高( 为对照的1.18 ～1.78倍) 。这表明NaCl 胁迫可轻微诱导杜梨叶片中POD、CAT、GR、GSH-Px 和APX 活性提高，抑制SOD的活性。施加5 ～100 μmol/LRib 后，抗氧化酶活性均随着Rib 浓度的增加呈现先增强后减弱的趋势。当Rib 浓度为10 μmol/L时，抗氧化酶活性与单独盐胁迫处理间的差异最显著( 为盐胁迫下的1.46 ～1.95 倍) ( 表2) 。然而，当Rib 浓度为50 ～100 μmol/L时，抗氧化酶活性较10 μmol/L Rib 处理又显著降低，且100 μmol/L Rib 处理与单独盐胁迫处理相比较，抗氧化酶活性无显著差异( 表2) 。

表1 核黄素(Rib) 对NaCl 胁迫下杜梨叶片产生速率、H2 O2和MDA 含量的影响Table 1 Effects of riboflavin( Rib) on production rate of ，contents of H2O2 and MDA in the leaves of Pyrus betulaefolia under NaCl stress

表1 核黄素(Rib) 对NaCl 胁迫下杜梨叶片产生速率、H2 O2和MDA 含量的影响Table 1 Effects of riboflavin( Rib) on production rate of ，contents of H2O2 and MDA in the leaves of Pyrus betulaefolia under NaCl stress

不同小写字母代表不同处理间在0.05 水平上差异显著。

处理NaCl(μmol/L)Rib(μmol/L)H2O2含量( nmol/g)O2·－产生速率［nmol/( g·min) ］丙二醛含量( nmol/g)0 0 70.04 ±5.68 c 2.39 ±0.23 d 16.73 ±1.13 cd 200 0 157.07 ±11.91b 5.67 ±0.69c 27.38 ±1.22ab 200 5 87.00 ±7.62c 3.16 ±0.28d 24.77 ±1.23bc 200 10 76.33 ±5.55c 2.54 ±0.19d 20.81 ±1.17c 200 50 196.33 ±16.64a 6.49 ±0.41a 30.39 ±1.61a 200 100 223.00 ±11.89a 7.78 ±0.31a 32.10 ±1.63a

表2 核黄素对NaCl 胁迫下杜梨叶片中抗氧化酶活性的影响Table 2 Effect of riboflavin on the activities of antioxidative enzymes in the leaves of P. betulaefolia under NaCl stress

2.3 核黄素对盐胁迫下杜梨叶片抗氧化物质含量的影响

盐胁迫(200 μmol/L NaCl) 处理3 d 后，杜梨叶片中抗氧化物质GSH 和AsA 的含量显著降低( 仅为无盐胁迫对照的38.2% ～44.9%) ( 表3) ，严重影响了植株自身清除自由基的能力。施加5 ～100 μmol/L核黄素后，抗氧化物质含量随着核黄素浓度的增加呈现先增加后减少的趋势( 表3) 。当Rib 浓度为5 ～50 μmol/L时，GSH 和AsA 含量较单独盐胁迫处理显著提高，其中以Rib 浓度为10 μmol/L时差异最显著，含量分别为盐胁迫下的3.76 和2.35 倍。而当Rib 浓度为100 μmol/L时，抗氧化物质含量反而降低，与盐胁迫下的无显著差异( 表3) 。

表3 核黄素对NaCl 胁迫下杜梨叶片中抗氧化物质GSH 和AsA 含量的影响Table 3 Effect of riboflavin on antioxidants (GSH and AsA) contents in the leaves of P. betulaefolia under NaCl stress

3 讨论

正常生长条件下，植物体内活性氧的产生和清除保持一种动态平衡，而在盐胁迫下，植物体内活性氧的积累是导致伤害的主要原因之一［34-35］，细胞内活性氧的爆发，会打破其产生和清除之间的平衡，积累大量的丙二醛( MDA) ，造成膜脂过氧化［36］。对萝卜和小麦的研究结果表明，盐胁迫下产生速率、H2O2和MDA 含量急剧增加，而外源油菜素内酯( EBR) 显著降低了的产生速率，以及H2O2和MDA 含量［4，37］，明确EBR 能抑制植物细胞膜脂过氧化，起缓解盐胁迫的作用。本试验发现，在盐胁迫下，杜梨叶片中的产生速率、H2O2和MDA 含量均显著增加;施加5 ～10 μmol/L核黄素后，产生速率及H2O2和MDA 含量显著降低，表明核黄素与EBR 作用类似，施加低浓度(5 ～10 μmol/L) 核黄素能有效抑制植物细胞膜脂过氧化，有提高杜梨耐盐能力的潜能。

SOD 是植物体内清除活性氧的第一道防线［38-39］，植物的耐盐性与SOD 活性的强弱直接相关［40-41］，它的主要功能为催化超氧阴离子发生歧化反应生成过氧化氢( H2O2) ，H2O2进一步通过CAT、POD 等抗氧化酶转化为水和氧气而被清除［42］。同时CAT、POD、APX 和GR 是AsA-GSH 循环不可或缺的组成部分。GSH-Px 可以清除由活性氧和OH·－诱发的脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的稳定性。外源ALA 处理可提高盐胁迫下菠菜和油菜叶片中SOD、POD、CAT 和APX 的活性，这可能是因为ALA 是血红素生物合成的前体，外源ALA 处理促进了血红素蛋白分子的活性［5，43］。而本试验观察到10 μmol/L核黄素处理后，杜梨叶片中抗氧化酶( SOD、POD、CAT、GR、GSH-Px 和APX) 活性都较盐胁迫处理和无盐胁迫对照植株显著增强，这可能与核黄素衍生物FAD 是许多抗氧化酶辅助因子有关［7］，从而显著降低活性氧含量，减轻膜质过氧化程度( 丙二醛含量下降) 。由此可见，核黄素处理能显著提高抗氧化酶活性，增强植株对盐胁迫的防御能力，避免植物体受到伤害。

GSH 和AsA 是最主要的抗氧化物质，通过参与AsA-GSH 循环将H2O2转化为对细胞无害的水和氧气从而维持细胞功能［12］。施用外源油菜素内酯( EBR) 可以提高盐胁迫下小麦中抗氧化物质( GSH和AsA) 的含量，增强活性氧清除能力而保护植物细胞［4］。本试验发现，施加5 ～10 μmol/L核黄素后，GSH 含量较盐胁迫处理和对照均显著升高; 10 μmol/L核黄素处理后，叶片AsA 含量较单纯盐胁迫处理显著升高。产生的大量AsA 和GSH 参与AsAGSH 循环代谢，APX 活性增加，将AsA 作为电子供体使H2O2生成水的能力增强，产生的脱氢抗坏血酸( DHA) 通过GSH 作为电子供体再次生成AsA，其产物氧化型谷胱甘肽( GSSG) 通过GR 又转变成GSH，经过这一系列循环反应来清除活性氧［44］，从而对植物体内的抗氧化系统起到保护作用。

众所周知，植物体中抗氧化系统包括抗氧化酶和抗氧化物质，它们都参与植物体中的抗氧化反应，清除活性氧，因此抗氧化酶活性与抗氧化物质和活性氧含量在植物体中是息息相关的。核黄素及其衍生物FAD 和FMN 是植物光合作用、能量生成和氧化还原代谢不可或缺的组成部分［7］。虽然核黄素是一种光敏剂，在曝光下可以生成单线态氧和超氧化物阴离子［45-46］，从而诱导植物细胞产生活性氧［9，43］，但是核黄素衍生物FAD 是许多抗氧化酶调节清除H2O2所必需的辅酶［47-48］。活性氧在植物体中的作用亦与其含量相关，低浓度活性氧可以调节诱导逆境防御基因，而高浓度活性氧会破坏细胞稳定性，导致细胞死亡［49-51］。因此核黄素对植物体抗氧化系统的影响是复杂的。本研究结果显示: 200 mmol/L NaCl 盐胁迫下施加10 μmol/L核黄素后，杜梨幼苗活性氧产生速率、H2O2和MDA 含量较单纯盐胁迫处理显著降低，而抗氧化酶( SOD、POD、CAT、GR、GSH-Px 和APX) 活性和抗氧化物质( GSH和AsA) 含量均较单纯盐胁迫处理显著增高。结合核黄素及活性氧的生理作用，可以推测本研究中，核黄素主要通过控制活性氧产生量来调节植物体中的抗氧化系统，但具体作用机制还有待进一步研究。

综上所述，200 mmol/L 盐胁迫下施加低浓度(5 ～10 μmol/L) 核黄素可以有效缓解杜梨叶片的氧化伤害，具体表现为活性氧含量显著降低，膜质过氧化程度减轻，抗氧化酶活性和抗氧化物质含量增加，该过程主要与核黄素参与的活性氧代谢相关。

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