葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析及表达

王西成， 吴伟民， 巫建华， 赵密珍， 王壮伟， 钱亚明， 解振强

(1.江苏省农业科学院园艺研究所，江苏 南京210014; 2. 江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京210014;3.江苏现代园艺工程技术中心，江苏 句容212400)

葡萄是中国栽培最广泛的果树树种之一，截止到2011 年底，中国葡萄栽培面积为5.68×105hm2，总产量达9.17×106t，分别占世界葡萄栽培总面积和总产量的8.02%和13.17%，其中鲜食葡萄的栽培面积和产量已连续多年居世界第一位，并且继续呈现逐年上升趋势［1］。葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌引起的真菌性病害，多雨季节易发生，生长早期发病可导致新梢、花穗枯死，中后期发病可引起提早落叶或叶片大面积枯斑而严重削弱树势，进而影响翌年的产量，是严重危害葡萄生产的四大病害之一［2］。

近年来，植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重视，已陆续发现一些抗真菌蛋白质，β-1，3-葡聚糖酶是研究最多、应用最为广泛的抗真菌蛋白质之一，其对于真菌的抗性具有广谱性和持久性特点。该酶能够降解以β-1，3-葡萄糖链连接的葡聚糖酶系( 大多数病原真菌细胞壁的主要成分之一)，从而使细胞内含物外溢，导致病原菌死亡［3］。高等植物中普遍存在着β-1，3-葡聚糖酶，在正常环境条件下该酶含量较少，活性较低，但当植物受到外界因素刺激时( 如病原菌侵染、水杨酸处理等)，β-1，3-葡聚糖酶即可被诱导产生并积累［4］。已有研究结果表明，植物体内有多个编码β-1，3-葡聚糖酶的基因，其产物有酸性和碱性之分，分别定位于胞间和液泡内，但只有定位在液泡内的碱性β-1，3-葡聚糖酶才能够降解真菌菌丝壁，从而抑制其生长，而定位于胞间的酸性β-1，3-葡聚糖酶则没有抑菌活性［5］。目前，对于β-1，3-葡聚糖酶基因的研究较为深入，已从大豆［6］、毛竹［7］、白菜［8-9］、青花菜［10］、指天蕉［11］、甘蔗［12］等多种植物中分离到该基因序列，并且完成了部分基因的功能验证工作［13］。在葡萄上，尽管已有关于β-1，3-葡聚糖酶活性及其编码基因研究的报道［14-17］，但对于该基因在霜霉病菌诱导下的表达模式仍知之甚少。有鉴于此，本研究在完成葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因克隆的基础上，进一步对该基因在响应霜霉病菌诱导过程中的表达水平进行分析，以期为该基因在葡萄抗病育种基因工程中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验于2014 年9 月在江苏省农业科学院溧水植物科学基地内进行，供试材料为抗病性较强的8年生鲜食葡萄品种金星无核。葡萄霜霉病病原菌( Plasmopara viticola) 于江苏省农业科学院院内葡萄资源圃病叶上分离获得。

试验所用M-MLV 逆转录酶、Ex-Taq、DNaseⅠ、dNTP、pMD19-T 载体、荧光染料SYBR GreenⅠ均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; T4 DNA 连接酶购自Promega 公司; DL2000 Marker 和DNA 回收试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司; DH5α 感受态大肠杆菌( Escherichia coli) 菌株由作者所在的国家农业科技华东( 江苏) 创新中心高效园艺作物遗传改良实验室保存。

1.2 病原菌制备及接种

参考王西成等［18］的方法，从田间采回新鲜的葡萄霜霉病叶，流水冲洗干净，经蒸馏水冲洗后置于17 ～20 ℃黑暗环境中保湿( 相对湿度为95%) 24 h，诱发新的孢子囊。用湿棉球将新产生的孢子囊剥落于无菌水中，配成1 ml 8×104个霜霉病菌孢子囊悬浮液，并加入标定体积0.1%的吐温。接种前用载玻片萌芽法测定孢子囊的活性，萌发率高于85.0%为有效接种液。采用喷雾法对金星无核幼嫩叶片进行接种，然后套袋并放入湿棉球保湿。分别于接种后0 h、4 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 进行6 次取样，叶片采集后液氮速冻，并于－70 ℃冰箱中保存备用。

1.3 总RNA 提取与cDNA 合成

葡萄叶片总RNA 的提取参考北京华越洋生物科技有限公司生产的植物RNA 提取试剂盒说明书进行。以总RNA 为模板，根据北京百泰克生物技术有限公司生产的Bio Teke supermo ⅢRT Kit 试剂盒说明，利用引物P01 反转录合成cDNA 第一链，反转录条件为:50 ℃保温45 min，70 ℃保温10 min，冰上冷却后，－70 ℃保存备用。

1.4 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因cDNA 克隆

根据GenBank 中已登录的葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因( NM _001280967. 1) 和 UBI 基 因( XM _002266714) 序列设计引物，并由上海英潍捷基贸易有限公司( http: //www.invitrogen.com) 合成，引物序列详见表1。以cDNA 为模板，分别利用引物P02/P03、P04/P05 和P06/P07 进行PCR 扩增获得葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的开放阅读框( ORF) 及5'和3'非编码区( UTR) 序列。反应体系均为25.00 μl:上、下游引物各1.00 μl(10 μmol/L) ，Ex-Taq (5 U/μl) 0.25 μl，10×PCR buffer ( 含Mg2+) 2.50 μl，dNTP 混合溶液(10 mmol/L) 2.00 μl，cDNA 2.00 μl，ddH2O 补至25.00 μl。反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段利用DNA 凝胶回收试剂盒进行回收，最后将目标片段连接到pMD-19T simple 载体上进行T/A 克隆，DNA 测序由上海美吉生物医药科技有限公司( http: //www.majorbio.com) 完成。

表1 引物序列及片段大小Table 1 Sequence of primers and size of amplified product

1.5 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列分析

首先利用DNAMAN 5. 22 软件对ORF、5'末端和3'末端3 个序列进行拼接分析。核苷酸和氨基酸序列分别利用 NCBI 的 BLASTn 和BLASTp( http: //blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi) 进行相似性分析，用DNAMAN 5. 22 软件分析葡萄β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列与其他植物的关系。

1.6 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因表达分析

分别提取金星无核葡萄接种霜霉病菌后不同时期的叶片总RNA，经DNase Ⅰ消化后分别取2 μg，并以P0 1 引物进行反转录合成cDNA。利用Primer 3 引物设计软件( http: //frodo. wi. mit. edu/primer3 /) 进 行 相 关 引 物 的设计，研究该基因在金星无核葡萄中的时空表达情况。以葡萄看家基因UBI 作为内标基因进行qRT-PCR 分析，目的基因相关引物序列见表1。qRT-PCR 见文献［1 9］，利用Bio-Rad My-IQ2 荧光定量PCR 仪，对目的基因的表达情况进行实时荧光定量分析。反应体系按照SYBR Green I( TOYOBO) 的说明书进行，反应条件为: 9 5 ℃预变性1 0 s; 9 5 ℃变性1 0 s，Tm 退火2 0 s，7 2 ℃延伸3 0 s，4 0 个循环，试验共设置3 次重复，反应结束后采用△△Ct法对荧光定量PCR 扩增数据进行处理，目的基因的相对表达量通过2－△△Ct值来确定。

2 结果与分析

2.1 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的cDNA 克隆及序列分析

根据GenBank 中已登录的酿酒葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列设计特异引物，以金星无核葡萄叶片的cDNA为模板进行PCR 扩增，分别获得了1 083 bp、691 bp 和325 bp 的3 条片段。将上述3 条片段进行克隆、测序，以及拼接组装，最终获得1 条总长为1 244 bp 的cDNA 序列。该序列包括1 个1 083 bp 的完整开放阅读框( ORF) ，33 bp 的5'非编码区和128 bp 的3'非编码区( 图1) 。该基因ORF 区包含一个含有360 个氨基酸的蛋白质，BioXM 2.6 预测该鲜食葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因所编码蛋白质的分子量为89 440，理论等电点为4.83。再将获得的ORF 序列与GenBank 中已登录的酿酒葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列进行同源性比对发现，在编码的360 个氨基酸中，仅第204、234、249 和306 位上的氨基酸存在差异，两者相似度高达98.9%( 图2) 。

2.2 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因所推导的氨基酸序列及其系统发育关系分析

为了解不同物种β-1，3-葡聚糖酶基因的进化关系，本研究从NCBI 公共数据库中下载了油棕、姜、百合、玉米、豌豆、桃和水稻共7 个物种的β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列，用DNAMAN5.22 软件进行序列比对和系统进化树的构建。结果显示，8 条蛋白质序列含334 ～377 个氨基酸残基，序列之间相似性均较低，说明不同物种β-1，3-葡聚糖酶基因在进化过程中发生了较大变化(图3)。

图1 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of grape beta-1，3-glucanase gene

图2 鲜食与酿酒葡萄β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列比对Fig.2 The alignment of beta-1，3-glucanase amino acid sequences in table and wine grapes

系统进化分析结果显示，葡萄β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列与其他物种之间遗传距离均较远，在全部比较的8 个物种中，除与酿酒葡萄同源性较高(98.9%) 外，与桃、豌豆、姜、油棕、百合、玉米的同源性为50.9% ～62.1%，而与水稻的同源性最低，仅为33.1%( 图4) 。

图4 葡萄与其他植物β-1，3-葡聚糖酶系统进化分析Fig.4 Phylogenetic tree of beta-1，3-glucanase among grape and other plants based on amino acid sequence

2.3 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的表达

为了解葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因在葡萄叶片接种霜霉病菌后不同时期的表达情况，本研究以UBI作为内参基因，利用qRT-PCR 技术对该基因在葡萄叶片接种霜霉病菌后不同时期的表达情况进行了对比分析。结果显示，在接种霜霉病菌后的72 h 内，葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的相对表达水平均高于处理0 h ( 对照) ，且呈现出先升后降的变化趋势，尤其在处理后24 h 时，该基因的相对表达量达到最高，约为对照的5.6 倍，之后出现较大幅度下降( 图5) 。上述结果表明，霜霉病菌侵染可诱导葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因表达。

3 讨论

葡萄霜霉病遍及世界各个葡萄产区，是葡萄生产上重要的真菌性病害之一［20-23］，当前对于该病害的防治主要依赖于杀菌剂，过度及不适当地使用杀菌剂不仅会危及食品安全，还会对环境造成严重危害，因此培育抗病品种已成为解决这一病害的有效途径。传统的育种方法需要通过对杂交后代表型进行初步筛选，此过程不仅费时耗财，且不易选育出理想的优质抗病葡萄新品种［24］。自20 世纪后期以来分子生物学技术取得了快速发展，这为缩短葡萄育种周期，加快抗病新品种的选育进程带来了新的契机。将分子生物学技术充分应用到葡萄育种过程之中不仅可以大幅缩短葡萄育种年限，同时还可以有效提高定向育种效率，已引起葡萄育种工作者的高度重视。

图5 霜霉病菌侵染后β-1，3-葡聚糖酶基因的表达Fig.5 Expression of beta-1，3-glucanase gene infected by Plasmopara vitieola

早在1992 年，Keen［25］就指出植物的抗病性是植物为了抵抗病原物的侵染、扩展和危害而在形态结构和生理生化，以及时间和空间上的综合表现，其实质是抗病相关基因表达的结果。分子生物学研究结果同样表明，植物在受到病原菌侵染时，其体内的部分转录因子会被激活，进而调控下游抗病基因的表达，从而达到抗病的目的［26-27］，如中国野生葡萄转录因子VpWRKY1 和VpWRKY2 可显著提高转基因拟南芥对白粉病的抗性［28］; VvPR1 基因的表达会因霜霉菌的诱导而表现为强烈上调［29］; 欧洲葡萄VST1 基因瞬时过量表达的叶片对于霜霉病的抗性也会增强［30］。近年来，有关葡萄转基因抗病育种也取得了一定进展，将中国野生葡萄STS 基因转化欧洲葡萄后，转基因植株中的白藜芦醇含量会显著高于对照，这有助于提高转基因植株的抗病性［31］; 而将环形抗菌肽基因转化欧洲葡萄后，不仅可以大幅提高转基因植株对于冠瘿病的抗性，同时也可在一定程度上提高其对葡萄白粉病的抗性［32-33］。

鉴于β-1，3-葡聚糖酶在植物抗病过程中所发挥的重要作用，本研究以对霜霉病抗性较强的葡萄品种金星无核为试验材料，采用RT-PCR 技术成功获得1 个1 244 bp 的葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列。葡萄霜霉病菌接种试验结果表明，葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因受霜霉病菌诱导上调表达，进而推测该基因能够响应葡萄霜霉病菌的诱导，进而参与葡萄对霜霉病菌的防御反应。

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