苏丹草管状分子体外诱导及木质素合成相关酶活力的变化

刘兆明， 钟小仙， 钱 晨， 刘大林

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州225009; 2.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京210014)

植物的次生细胞壁主要沉积在包括木质部中起输导和支持功能的细胞中，如管胞和导管分子，二者统称为管状分子，管状分子是一种无原生质体、壁加厚的非生活细胞，为植物木质部输导结构，兼具支持功能，存在于所有维管植物中，分化成熟过程中会发生明显的形态学变化，形成特征性的加厚的次生细胞壁。自1975 年Kohlenbach 等［1］首次发现百日草( Zinnia elegans L.) 机械分离的单个叶肉细胞可以直接分化形成管状分子后，迄今已建立了百日草［2］、拟南芥［Arabidopsis thaliana ( Linn.) Heynh.］［3］、烟草( Nicotianatabacum L.)［4］、杨树( Populus tremula ×P.tremuloides)［5］、辐射松( Pinus radiate D. Don)［6］和花旗松( Pseudostuga mensziesii)［7］等的管状分子体外诱导体系，为植物次生细胞壁及其木质素合成机制研究提供了简单有效的模式系统，但C4 作物管状分子体外诱导体系尚未见报道。

木质素是一种酚类聚合物，在管状分子分化成熟过程中不断掺入次生细胞壁中，从而增加细胞壁的硬度。木质素由香豆醇、松柏醇、芥子醇3 种单体在多种酶综合调控下聚合而成。苯丙氨酸解氨酶( PAL) 是限速酶，对木质素的合成起总开关的作用;肉桂醇脱氢酶( CAD) 催化松柏醇和芥子醇单体合成的最后一步反应，是木质素合成的重要调节酶;过氧化物酶( POD) 催化木质素单体聚合过程，参与调节木质素在细胞壁的沉积［8］。可溶性酚醛组分为植物次生细胞壁与木质素合成过程的中间物质［9］。研究次生细胞壁合成过程中木质素含量及其相关酶活性的变化，对解析次生细胞壁合成机制及植物定向改良具有重要意义。

苏丹草［Sorghum sudanense( Piper.) Stapf.］为禾本科( Poaceae) 高粱属( Sorghum) 牧草［10-11］，具有生物产量高、耐贫瘠、抗干旱、可多次刈割及光合效率高的特性，作为能饲粮兼用型禾本科C4 作物正日益受到世界各国的重视［12-13］。本研究以苏丹草新品系苏牧3 号愈伤组织为材料，通过研究光照培养时间、培养基中有无植物激素和不同活性炭浓度对管状分子分化率的影响，建立苏丹草管状分子体外诱导技术体系，并通过研究管状分子诱导过程中木质素含量、可溶性酚醛组分含量及其相关酶活力变化，探索苏丹草次生细胞壁与木质素合成调控机制，为苏丹草定向育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

苏丹草新品系苏牧3 号淡黄色愈伤组织，由江苏省农业科学院畜牧研究所提供。

1.2 培养基成分

基本培养基由MS 大量元素、MS 微量元素［14］、B5有机成分［15］组成，添加蔗糖30 g/L、琼脂条8 g/L，培养基在高压灭菌前用氢氧化钠或盐酸调整pH 值至5.8。

愈伤组织继代培养基SM: 在基本培养基中添加2，4-D 2.0 mg/L和6-BA 0.05 mg/L;管状分子诱导培养基( TEM 和TESM) : 在基本培养基和继代培养基中分别添加0 g/L、1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L的活性炭( 表1) 。

1.3 管状分子分化率的测定方法

将继代培养基中培养28 d 的淡黄色颗粒状愈伤组织转入不同的管状分子诱导培养基中，每个处理设3 个重复，每个重复接种4 瓶，每瓶接种20 块愈伤组织，分别在黑暗和每天16 h 光照条件下培养28 d。管状分子诱导培养期间，每隔2 d 取样，每个重复随机选取2 块愈伤，用刀片分别切取愈伤组织块表面2 mm 的部分，10% NaOH 浸泡过夜后蒸馏水冲洗3 次，用0.01%番红染色30 min，光学显微镜明场下进行图像采集，每块愈伤组织随机挑选10个图像进行细胞计数和管状分子分化率的测定，管状分子分化率计算公式如下:

管状分子分化率=图像中管状分子总数/图像中细胞总数×100%。

表1 管状分子诱导培养基配方Table 1 Concentration of activated carbon in the media

1.4 管状分子形态学特征的观察

用光学显微镜对管状分子诱导培养期间的形态学特征进行观察，并将采集的图像进行管状分子形态特征分析。

1.5 可溶性酚醛组分含量与木质素含量分析

以黑暗条件下继代培养的愈伤组织和最适宜的管状分子诱导培养条件下培养的愈伤组织为材料，每隔3 d 取样，参照MÖller 等［9］的方法，进行可溶性酚醛组分含量和木质素含量测定，参照Krishnamurthy 等［16］的方法，对最适宜的管状分子诱导培养条件下的愈伤组织，采用间苯三酚进行木质素特异染色，用数码相机进行图像采集。

1.6 PAL、CAD、POD 活力的测定

以黑暗条件下继代培养的愈伤组织和最适宜的管状分子诱导培养条件下培养的愈伤组织为材料，每隔3 d 取样，PAL 活力测定参照Edwards 等［17］的方法; CAD 活力测定参照Wyrambik 等［18］的方法;POD 活力测定采用POD( 植物) 试剂盒( 购自南京建成生物工程研究所) 。

1.7 数据统计

用Excel 软件进行数据统计，使用SAS9.2 软件进行方差分析，采用新复极差法进行多重比较。

2 结果

2.1 光照、外源植物激素和活性炭对愈伤组织管状分子分化率的影响

将继代培养基中培养28 d 的淡黄色颗粒状愈伤组织( 图1) 转入不同的管状分子诱导培养基中，在黑暗和每天16 h 光照条件下培养。结果见图2。

图1 继代培养28 d 的愈伤组织Fig.1 Calli subcultured for 28 d of sudangrass

在各种不同的培养基上，每天16 h 光照条件培养的愈伤组织管状分子分化率为 17.15% ～51.97%，平均值为33.60%，黑暗条件下培养的愈伤组织管状分子分化率为0 ～34.9%，平均值为20.36%，每天光照16 h 培养极显著提高了愈伤组织的管状分子分化率( P ＜0.01) 。

在不含外源植物激素的基本培养基中，添加不同浓度活性炭培养的愈伤组织管状分子分化率为0 ～51.97%，平均值为26.00%。在含外源植物激素的继代培养基中，添加不同浓度的活性炭，培养的愈伤组织管状分子分化率为0 ～45.54%，平均值为27.95%，二者差异不显著( P ＞0.05) 。

进一步的分析发现，培养时有无光照、培养基中是否含外源植物激素和培养基中不同活性炭浓度对愈伤组织管状分子分化率的影响存在极显著的交互作用，以不含外源植物激素的基本培养基中添加3 g/L 活性炭每天光照16 h 培养的处理( TEM3) 为管状分子诱导最优化培养条件，在此培养条件下愈伤组织管状分子分化率最高，为51.97%。

黑暗培养条件下，选用不含外源植物激素的基本培养基或含外源植物激素的继代培养基、不添加活性炭，对愈伤组织培养28 d，未观察到管状分子分化。每天光照16 h 培养条件下，不同培养基处理愈伤组织管状分子开始出现的时间为开始培养后4 ～6 d，管状分子分化率达到最高值的时间为开始培养后18 ～26 d。

图2 光照时间、外源植物激素和活性炭浓度组合对管状分子分化率的影响Fig.2 Effect of illumination time duration，ogenous hormone and activated carbon concentration on differentiation rate of tracheary elements

2.2 愈伤组织中可溶性酚醛组分含量与木质素含量变化

每天光照16 h、基本培养基中添加3 g/L活性炭试验组，在诱导愈伤组织管状分子分化过程中，可溶性酚醛组分含量随诱导天数增加呈现先增后减的变化规律( 图3) ，在培养第12 d 时达到最高( 1.09 μg/mg) ;黑暗条件、继代培养基中不添加任何植物激素的对照组，愈伤组织中的可溶性酚醛组分含量为0.72 ～0.75 μg/mg，不同培养天数间无显著差异;管状分子诱导培养3 d 以前和21 d 以后，可溶性酚醛组分含量试验组和对照组间无显著差异，培养3 ～21 d时试验组的可溶性酚醛组分含量均极显著高于对照组。

每天光照16 h、基本培养基中添加3 g/L活性炭试验组，木质素含量随管状分子诱导培养天数的增加极显著提高( 图4) ，管状分子诱导培养21 d 时木质素含量达到最高( 18.11%) ，此后木质素含量无显著变化;黑暗条件、继代培养基中不添加任何植物激素的对照组，愈伤组织中的木质素含量为0.26% ～0.35%，不同培养天数间无显著变化;试验组管状分子诱导培养3 d 以前与对照组的木质素含量无显著差异，其余培养时间试验组的木质素含量均极显著高于对照组。

图3 苏丹草愈伤组织可溶性酚醛组分含量变化Fig.3 The change of soluble phenolic components contents in sudangrass calli

图4 苏丹草愈伤组织木质素含量变化Fig.4 The change of lignin content in sudangrass calli

对每天光照16 h、基本培养基中添加3 g/L活性炭培养的愈伤组织块及其匀浆液，采用盐酸-间苯三酚进行木质素特异染色( 图5) ，结果显示，在愈伤组织管状分子诱导培养21 d 内，随培养时间的延长，愈伤组织块表面红色面积逐渐增多，匀浆液红颜色逐渐加深; 管状分子诱导培养24 d 和27 d 时，由于愈伤组织块表面部分出现褐化，采用盐酸-间苯三酚染色后愈伤组织块表面和匀浆液呈红褐色和棕褐色。

2.3 愈伤组织诱导的管状分子的形态特征

显微观察结果表明，大量管状分子呈集团状分布于愈伤组织细胞簇中( 图6A) 。将视野放大，可以观察到不同形态特征的单个管状分子，主要有两种类型:一种为两头尖、两端不开口的管胞，另一种是伸长的、两端开口的导管分子( 图6B) ;同时，在视野中也可以观察到处在不同发育阶段的管状分子:一是发育早期的管状分子轮廓模糊，次生细胞壁增厚不明显，骨架结构不完整( 图7A) ;二是发育中期的管状分子轮廓结构清晰，但骨架结构还不完整，次生细胞壁明显加厚( 图7B) ;三是发育成熟的管状分子骨架结构完整，次生细胞壁显著增厚，形成不同类型的纹孔( 图7C) 。成熟的管胞类型中绝大部分为网状管胞( 图7F) ，还有部分梯状管胞( 图7D) 。还可以观察到成熟管胞以其倾斜的两端相互连接形成的输导组织( 图7E) ; 导管分子大部分为网状类型( 图7G) ，也可以观察到少量孔状类型( 图7H) ，大量发育成熟的导管分子通过端壁的穿孔相互连接形成导管( 图7I) 。

2.4 愈伤组织中PAL、CAD、POD 活力变化

每天光照16 h、基本培养基中添加3 g/L活性炭的试验组，管状分子诱导培养0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、18 d 和21 d 时，愈伤组织中的PAL 活力随培养天数的增加而显著提高( 图8) ，但PAL 活力诱导培养15 d 与9 d 无显著差异，但显著低于12 d，诱导培养21 d 时PAL 活力达到最高( 5.915 0 ×10-3U/mg) ，且随后的诱导培养24 d、27 d 的愈伤组织中PAL 活力较诱导培养21 d 未发生显著变化;黑暗培养、继代培养基中不添加活性炭的对照组，继代培养3 d 和6 d 的愈伤组织中PAL 活力无显著差异，但显著高于初始培养时愈伤组织中PAL活力，黑暗条件、继代培养基培养6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d，愈伤组织中的PAL 活力随培养天数增加而降低，黑暗条件、继代培养基培养21 d、24 d和27 d 间PAL 活力无显著差异，但均极显著低于黑暗条件、继代培养基培养3 d 时的PAL 活力;PAL 活力试验组管状分子诱导培养3 d 时开始极显著高于对照组。

每天光照16 h、基本培养基中添加3 g/L活性炭的试验组，管状分子诱导培养0 d、3 d、6 d、9 d 时，愈伤组织中的CAD 活力随培养天数的增加而极显著提高( 图9) ; 管状分子诱导培养9 d、12 d、15 d 时，愈伤组织中的CAD 活力无显著差异，但均极显著高于管状分子诱导培养6 d 时的CAD活力; 管状分子诱导培养21 d 时，CAD 活力最高( 8.366 7 ×10-2U/mg) ，但与管状分子诱导培养18 d、24 d、27 d 时的CAD 活力无显著差异。黑暗条件、继代培养基培养3 d 时，愈伤组织中的CAD 活力最高，其余培养天数间CAD 活力无显著差异; CAD 活力试验组管状分子诱导培养6 d 时开始极显著高于黑暗条件、继代培养基培养的对照组。

每天光照16 h、基本培养基中添加3 g/L 活性炭的试验组，管状分子诱导培养3 d、6 d、9 d时，愈伤组织中的POD 活力随培养天数的增加而极显著提高( 图10) ，且管状分子诱导培养9 d时POD 活 力 达 到 最 高( 132. 24 U/mg) ，此 后POD 活力都极显著高于黑暗继代培养的对照组;黑暗继代培养的愈伤组织，除培养3 d 时的POD活力最低外，其余培养天数间POD 活力均无显著差异。

图5 管状分子诱导培养0 ～27 d 的愈伤组织块及其匀浆液盐酸间苯三酚染色图片Fig.5 Calli and their homogenate stained with phloroglucinol-HCl after 27-d induction

图6 苏丹草愈伤组织诱导的管状分子Fig.6 Tracheary elements induced in sudangrass calli

图7 苏丹草愈伤组织诱导的管状分子类型Fig.7 Types of tracheary elements induced in sudangrass calli

图8 苏丹草愈伤组织PAL 活力变化Fig.8 The change of PAL activity in sudangrass calli

图9 苏丹草愈伤组织CAD 活力变化Fig.9 The change of CAD activity in sudangrass calli

图10 苏丹草愈伤组织POD 活力变化Fig.10 The change of POD activity in sudangrass calli

3 讨论

Mizuno 等［19］研究发现，光照对胡萝卜( Daucus carota L.) 根外植体管状分子分化是必需的，胡萝卜根外植体只有在光照培养条件下才能正常生长和进行管状分子分化。冰叶日中花( Mesembryanthemum crystallinum L.) 愈伤组织也只有在光照培养条件下才出现管状分子分化，管状分子分化率为20%［20］。MÖller 等［5］研究指出，光照对辐射松( Pinus radiate D. Don) 愈伤组织体外管状分子分化是非必需的，在添加2 g/L活性炭不含植物激素的培养基中，黑暗培养条件下管状分子分化率可达12.63%，Möller等［21］进一步研究发现，在添加2 g/L活性炭不含植物激素培养基中，每天光照24 h 培养条件下管状分子分化率达到31.75%。本研究结果表明，光照对苏丹草愈伤组织管状分子分化是非必需的，每天光照16 h 和黑暗培养条件下管状分子分化率的平均值分别为33.60%和20.36%，每天光照16 h 培养可以极显著提高苏丹草管状分子分化率。

植物激素作为植物组织培养必需的营养成分，在培养基中添加适当比例的植物激素可以维持离体培养细胞正常的生长和发育。在植物管状分子体外诱导过程中，培养基中是否含有植物激素也会影响体外管状分子的分化率。Möller 等［5，21］研究发现，在每天光照24 h、不含活性炭和植物激素的培养基中，辐射松管状分子分化率为32.26%，若在培养基中添加4.5 μmol/L 2，4-D 和2.6 μmol/L 6-BA，管状分子分化率将低于1%。Oda 等［3］利用拟南芥悬浮培养细胞进行体外管状分子分化研究时发现，2，4-D 会抑制管状分子分化，用不含2，4-D 的液体培养基冲洗悬浮细胞4 次，在培养基中添加0 μmol/L、0.04 μmol/L、0.41 μmol/L、4.10 μmol/L 2，4-D，结果显示，在诱导培养168 h 时，2，4-D 浓度为0 μmol/L处理的管状分子分化率为30%，而2，4-D 浓度为4.10 μmol/L处理的无管状分子产生。百日草叶肉细胞悬浮培养体系中，添加0.1 mg/L NAA和1 mg/L 6-BA，管状分子的分化率可达到30%［22］，添加0.1 μmol/L NAA 和0. 2 μmol/L 6-BA，诱导的管状分子分化率为25% ～40%［23］，添加0.5 μmol/L NAA 和0. 5 μmol/L 6-BA，百日草管状分子的分化率最高达53%［24］。活性炭是植物组织培养常用的介质，具有强烈的吸附性能，可以吸附植物细胞培养过程中产生的酚类物质，同时也可以吸附添加到培养基中的营养成分和植物激素等，从而对培养物的发育、生长和分化产生促进或抑制作用［25］。Möller 等［9］研究发现，在含有4.5 μmol/L 2，4-D 和4.4 μmol/L 6-BA 的辐射松悬浮培养体系中未添加活性炭，没有出现管状分子分化，而在不含植物激素的培养基中添加2 g/L活性炭，诱导培养18 d 时管状分子分化率可达18%。Yamagishiy等［26］研究指出，暗培养条件下，在不含植物激素的培养基中添加5 g/L的活性炭，日本榧树和日本柳杉诱导培养4 周，管状分子分化率可以达到47.2%和31.0%，均显著高于未添加活性炭处理的管状分子分化率。本研究结果表明，植物激素和活性炭之间具有显著的交互作用，在每天光照16 h 培养条件下，以不含植物激素的基本培养基中添加3 g/L活性炭时管状分子分化率最高( 51.97%) ; 在暗培养条件下，以含有2.00 mg/L 2，4-D + 0.05 mg/L 6-BA的继代培养基中添加5 g/L活性炭时管状分子分化率最高(34.79%) 。

管状分子在分化过程中会发生明显的次生细胞壁加厚，形成网状、螺旋状、孔状、梯状、环状等多种类型的纹孔［9］，其中木质素的沉积是次生细胞壁形成过程中的标志性动作［27］，木质素沉积是多种酶综合调控的结果，到目前为止，大部分参与木质素合成调控的酶都已被鉴定和分离，并进行了相关功能分析［28］。陈永忠等［29］研究指出，植物细胞壁在形成过程中会发生木质化，木质素会逐步掺入到细胞壁中，使细胞壁的硬度增加，起到支持植物体的作用。Möller 等［9］研究发现，在辐射松管状分子分化过程中利用紫外吸收光谱的方法发现了细胞外存在数量较多的液滴状物质，统称为可溶性酚醛组分［30］，其在诱导培养过程中呈现先增后减的变化规律，在诱导培养12 d 时达到最高值，经间苯三特异性染色呈现红色，证明与木质素同源，都含有芳醛结构，而芳醛是木质素合成的前体物质; 木质素含量随管状分子诱导培养时间的增加持续升高，在诱导培养18 d时达到最高值(18%) 。Sato 等［31］研究发现，在利用百日草叶肉细胞悬浮培养进行管状分子诱导过程中，PAL 和CAD 活力会伴随管状分子次生壁的不断木质化而显著升高; Möller 等［21］研究发现，辐射松愈伤组织在诱导培养8 d 时诱导率达到最高(45%) ，PAL 活力从诱导培养3 d 开始显著升高，在诱导培养5 d 时达到最高值，之后PAL 活力无显著变化;CAD 活力在诱导培养第9 d 时达到最高值。Zwliha 等［32］研究发现，在杨树中反向转入POD Shpx6a 基因，木质素含量降低，证明了POD 确实与木质素单体的聚合有关。本研究结果显示，苏丹草诱导形成的管状分子次生壁加厚大部分呈现网状，同时还有少量的梯状管胞和孔状导管分子; 可溶性酚醛组分含量随诱导培养时间的增加先升后降，诱导培养12 d 之后含量显著降低，与MÖller 等［9］在辐射松管状分子分化过程中的研究结果相似; 从诱导培养第3 d 开始PAL 和CAD 活力显著升高，在诱导培养21 d 时同时达到最高值，木质素含量在诱导培养21 d 时达到最高值(18.11%) ，之后木质素含量及PAL、CAD 活力都无显著变化，而POD 活力始终维持在较高的水平。由此可见，PAL、CAD、POD 活力与苏丹草体外管状分子诱导过程中木质素的合成具有显著的相关性。

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