间充质干细胞修复肝损伤的机制及膜微粒的生物治疗潜力*

阮承兰　综述，陈从新　审校

间充质干细胞修复肝损伤的机制及膜微粒的生物治疗潜力*

阮承兰综述，陈从新审校

【摘要】间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）移植是治疗肝硬化和肝衰竭的重要方式。MSCs修复肝损伤的机制主要有三种：干细胞分化为肝细胞样细胞，旁分泌作用和免疫调节功能及膜微粒（microvesicles，MVs）介导的信号传递。目前的研究表明，MVs介导的RNAs传递在组织修复中发挥着至关重要的作用，MVs移植可能成为修复肝损伤的一种新方式。本文重点介绍了移植入肝脏的MSCs可能的作用机制和MVs的生物治疗潜力。

【关键词】肝损伤；间充质干细胞；膜微粒；治疗

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的自我更新能力和多向分化潜能［1］。分布于骨髓、脐带（血）、肌肉、脂肪、肝脏、皮肤等多种组织器官的干细胞可被诱导分化为肝细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞和胰岛样细胞等，已用于多种临床疾病的治疗，以修复受损的组织器官。MSCs移植已成为治疗肝硬化和肝衰竭的重要方法。研究表明，MSCs移植可促进肝脏再生，并在一定程度上缓解患者的不适症状，改善肝功能和患者的短期预后［2，3］。进一步研究显示，MSCs在凋亡的过程中可释放膜微粒（microvesicles，MVs），后者介导的信号传递在组织修复中发挥极为关键的作用［4］。本文主要探讨MSCs修复肝损伤的机制和MVs的生物治疗潜力。

1　移植入肝脏的MSCs可能的作用机制

1.1干细胞分化为肝细胞样细胞移植入体内的MSCs随血流进入肝脏，穿过血管内皮间隙后进入肝组织，干细胞在局部肝损伤微环境所提供的细胞外信号的刺激下发生表型和功能的变化而分化为肝细胞样细胞。在体外，用含有肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4的诱导培养基对培养的人脐血MSCs进行诱导分化，对诱导后细胞AFP、CK18、白蛋白、抗肝细胞抗体等幼稚和成熟肝细胞标志的检测发现，诱导后的细胞具有肝系细胞的表型和功能［5］。Avital et al［6］用免疫磁珠法分选出人和大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs），通过门静脉植入胆汁淤积大鼠肝内，电镜下发现植入细胞具有与成熟肝细胞类似的超微结构，能表达ALB、AFP和CK-18等肝细胞特异性标志物，并且能合成尿素。陈建锋等［7］将人骨髓干细胞经门静脉移植入肝损伤大鼠肝脏内，于移植后14天和28天对大鼠的肝功能和肝脏组织学进行检测发现，移植组大鼠肝功能得到显著改善，人源性细胞在肝损伤大鼠肝脏中的替代率约为 10%，提示骨髓干细胞可在异体内分化为有功能的肝细胞样细胞。MSCs可在体内外特定微环境下分化为具有类似肝细胞形态和功能的肝细胞样细胞已得到上述研究的证实。1.2旁分泌作用和免疫调节功能MSCs除具有强大的增殖能力和多向分化潜能外，还兼有低免疫原性和免疫调节作用。其表面低表达人类MHCⅠ类分子，不表达人类MHCⅡ类分子及共刺激分子CD40、CD80和CD95等。因此，MSCs在体外不仅不能诱发免疫应答，反而具有抑制免疫反应的作用［8］。在体外将小鼠BMSCs与激活的鼠脾细胞或人脐带MSCs与激活的人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）共培养，结果表明MSCs可强烈抑制激活的脾细胞和PBMC增殖，且这种抑制呈剂量依赖性［9］。Di et al［10］研究发现，MSCs是通过分泌肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）来抑制自体或异体T淋巴细胞增生。此外，MSCs还能抑制单核细胞分化为树突状细胞［11］。

多项研究发现，定植于肝脏的BMSCs通过旁分泌的形式分泌多种细胞因子和生长因子，如IL-10、HGF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等，这些旁分泌物质在促进肝脏再生和修复的同时，能抑制肝脏炎症反应，改善凋亡诱导的肝损伤，提高血清白蛋白水平，促进细胞外基质的降解等［12～14］。

1.3MVs介导的信号传递几乎所有的真核细胞，包括干细胞及其前体细胞，在凋亡的过程中，均会通过质膜出芽的形式产生囊泡状MVs［15］。MVs为一种细胞亚结构，呈球形，具有细胞骨架和磷脂双层结构，但不具有细胞核和蛋白合成能力，其表面表达了大量的生物活性物质、粘附分子、锚定受体和细胞表面特异性抗原等［16］，膜内含有多种细胞因子、趋化因子、生长因子、酶类及信号蛋白，某些细胞来源的MVs还含有功能性的RNA以及微小RNA等［17，18］。MVs可以通过与受体细胞膜融合直接释放内含物（细胞因子、趋化因子、生长因子、酶类、信号蛋白和RNA等）的方式，或被受体细胞內吞，或通过膜表面分子与相应受体结合的方式激活目标细胞，使目标细胞的表型和功能发生改变［16，19］。

Camussi et al［20］发现，在组织修复过程中，MSCs与受损组织通过MVs相互传递基因产物，损伤组织将基因产物转移给干细胞后，干细胞的表型可重新编码，以获得损伤组织的特征；另一方面，MSCs来源的MVs所携带的基因产物可诱导在损伤中幸存的细胞重新进入细胞周期，以促进组织修复。当用RNA酶预处理人肝脏干细胞来源的MVs后发现，MVs所具有的促进肝细胞增值和抑制肝细胞凋亡的效应几乎完全消失，表明MVs介导的RNA转移是其发挥生物学作用的重要机制［21］。另有研究用相似的方法证实了RNA传递是MVs促进血管再生和发挥组织修复作用的分子机制［22，23］。Herrera et al［21］研究发现，来源于人肝脏干细胞的MVs可在体外诱导人和大鼠肝细胞的增殖并抑制其凋亡；在对大鼠进行肝脏大部分切除术的同时，将MVs经静脉注射到大鼠体内，在术后24 h、48 h和72 h均可检测到MVs移植组大鼠肝细胞增殖显著强于未进行MVs移植的对照组，且肝细胞的肿胀和脂肪变性显著低于对照组。

1.4MSCs作用机制探讨MSCs修复肝损伤的机制主要有上述三种，具体哪种机制在组织修复中发挥主要作用目前尚无一致意见，但明确干细胞的作用机制对生物治疗方式的选择与优化具有重要意义。

MSCs进入肝损伤微环境后可分化为肝细胞样细胞，但这些分化而来的细胞不仅数量少，而且并不具备成熟肝细胞的全部表型和功能［24］。移植入体内的少量MSCs不可能在短期内分化为功能性的肝细胞而发挥显著的抗损伤及组织修复作用。显然，MSCs分化为肝细胞样细胞不是MSCs发挥组织修复作用的主要方式。MSCs与受损肝细胞可通过MVs相互传递基因产物，在这一过程中，MSCs的表型可以重新编码，以获得损伤组织的特征［20］。据此推测，干细胞分化为肝细胞样细胞可能是MVs生物学作用的一种表现形式。Bi et al［25］研究发现，将人骨髓基质细胞经静脉或腹腔注射到顺铂诱导的急性肾衰竭小鼠体内，可显著减轻肾损伤。在注射后1～4天，对小鼠肾脏组织切片进行观察可见，肾小管内并无人骨髓基质细胞定植，仅在肾间质内观察到极少量的移植细胞。注射骨髓基质细胞的培养基，可以获得与细胞移植类似的效果，表明细胞移植不是必要的。

目前，已有多项研究证实，MSCs可以旁分泌多种细胞因子，且MSCs在凋亡的过程中释放MVs，这些细胞因子和MVs都可能对损伤组织的修复产生积极作用。Parekkadan et al［26］用D-氨基半乳糖诱导大鼠暴发性肝衰竭后24 h静脉注射BMSCs无明显疗效，而注射等量MSCs的溶解物则可改善大鼠的生存率；进一步研究发现，静脉注射MSCs条件培养基（conditioned medium，CM）可明显减轻损伤肝组织的白细胞浸润、肝细胞变性坏死和凋亡。

那么，在MSCs的溶解物和CM中，能发挥肝脏修复作用的有效成分究竟是旁分泌物质、MVs，还是其它成分，则无从得知。MVs和可溶性旁分泌物质在分子量、体积方面存在较大差异。因此，一些学者通过超速离心或过滤的方式将MSCs-CM中的成分分离开来，以分别研究不同物质在组织修复中所扮演的角色及其作用机制。

在心血管疾病领域，Lai et al［27］对心肌缺血再灌注模型的研究发现，MSCs-CM能明显减少心肌梗死的面积，而用滤过膜去除CM中分子量大于1000 KDa的物质后，其对心肌的保护作用几乎消失。若将上述大分子物质进行静脉输注，则可发挥与CM类似的心肌保护作用。这一研究结果表明，MSCs-CM的心肌保护作用似乎不只是源于分子量通常为十几个KDa的可溶性分子，MVs极有可能是MSCs发挥生物学效应的主要成分。MVs的发现和生物学作用的证实，丰富了MSCs组织修复作用旁分泌机制的内涵，MSCs旁分泌作用不再局限于细胞因子和趋化因子这些可溶性蛋白介导的信号传递。

在肾脏病领域，Reis et al［28］研究发现，在庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠模型中，静脉注射BMSCs，MSCs-CM或从CM中提纯的MVs均能抑制大鼠血清尿素氮和肌酐的升高，抑制肾实质细胞的坏死和凋亡并促进细胞增殖，可减少促炎性细胞因子并增加抗炎性细胞因子的水平，从而发挥肾脏保护作用。然而，当CM或MVs用RNA酶处理后，前述的肾脏保护作用显著减弱。提示BMSCs的肾脏修复作用主要由MVs携带的RNAs所介导。

这些在心血管疾病和肾脏病领域的研究结果提示了MVs穿梭的RNAs可能是MSCs发挥组织修复作用的主要机制。这也为MVs应用于损伤组织的修复提供了实验依据。

2　MVs的生物治疗潜力

目前，MVs移植仍处于实验研究阶段。BMSCs来源的MVs可在体外刺激肾小管上皮细胞增殖，并抑制其凋亡［23，29］，在甘油诱导的严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠急性肾损伤模型中，MVs治疗可加速肾脏形态和功能的恢复［23］。在这个实验模型中，静脉注射MVs可以取得与MSCs相似的治疗效果，表明MVs可以介导，或者至少部分介导MSCs的组织修复功能。在顺铂诱导的致死性急性肾损伤模型中，单次注射MVs可改善SCID小鼠的生存率，而不能阻止慢性肾小管损伤；在损伤后不同时间多次注射MVs，不仅可进一步提高SCID小鼠的生存率，而且可以完全避免慢性肾小管损伤［29］。将PKH26标记的MVs经静脉注射到肾脏缺血再灌注损伤大鼠体内，注射后2 h，在肾小球和肾小管腔中可检测到MVs。在注射后6 h，部分肾小管上皮细胞中出现MVs。2天后该组大鼠血清肌酐、尿素氮水平和肾小管病变程度均显著低于生理盐水对照组［30］。

体内外实验均表明，MVs可促进细胞的增殖并抑制细胞凋亡，可修复受损的组织细胞。现有研究结果显示，静脉注射MVs可改善急性肝损伤、心肌缺血再灌注损伤和急性肾损伤。这些研究成果也显示了MVs在生物治疗方面的潜力。

MVs制剂在生物治疗方面有着独特的优势，并可能替代MSCs移植用于组织损伤的修复［19］。第一，来源于MSCs的MVs具有一定的稳定性，可长时间保存。体外反复超速离心或在-20℃多次冻融并不影响其形态大小，但将MVs在4℃和37℃条件下保存数天，其体积会明显缩小［31］。将MVs在-20℃保存6个月并不影响其心肌保护作用和生物学活性［19］；第二，MVs体积小，易于穿过微血管到达靶器官，既能在较短时间内启动组织修复，又可减少因微循环阻塞所致的组织损伤。Gholamrezanezhad et al［32］用111In-oxine标记MSCs后经肘静脉注入失代偿期肝硬化患者体内，示踪结果显示，干细胞首先积聚在肺组织，数小时后逐渐转移至肝脏和脾脏，在数天后，肺组织和脾脏均有干细胞滞留。而将荧光标记的MVs经静脉注射到肾脏缺血再灌注损伤大鼠体内6 h即可在肝脏中检测到MVs，肺毛细血管中仅有很少量的MVs沉积［30］。因此，MVs可能更适于肝衰竭患者的治疗；第三，因为有磷脂膜的包被，MVs中含有的多种生物活性成分不易被体液中的酶类降解，从而保证了膜内蛋白成分和核酸结构的完整性和生物学功能不被破坏［27，33］；第四，MVs表面存在众多的粘附分子和锚定受体，与目标细胞上相应的配体及胞外基质有高度的亲和性，可将有效的生物学成分快速转运至特异组织及微环境［15，19］。除此之外，相对于MSCs移植，MVs制剂还能避免定植细胞可能的不良分化［34］和肿瘤的发生［35］。

MVs具有良好的组织修复特性，同时可以减少或避免细胞移植的副作用和并发症，为肝硬化和肝衰竭的治疗提供了新的选择。但其作为一种新的生物制剂应用于临床实践还任重而道远。如何获得足够数量和高纯度的MVs，MVs的最佳治疗剂量，经外周静脉注射后能否定向归巢，如何建立标准化的制备流程以获取性质稳定的MVs，MSCs-MVs应用于临床所涉及的伦理以及生物安全性等问题仍需要科研和临床工作者的共同努力。

【参考文献】

［1］陈海鸥，胡小宣，刘红娟，等.脐血干细胞移植治疗肝硬化的疗效观察.中华肝脏病杂志，2010，18（7）：537-538.

［2］Mou XZ，Lin J，Chen JY，et al.Menstrual blood-derived mesenchymal stem cells differentiate into functional hepatocytelike cells.J Zhejiang Univ Sci B，2013，14（11）:961-972.

［3］ Khan AA，Shaik MV，Parveen N，et al.Human fetal liver-derived stem cell transplantation as supportive modality in the management of end-stage decompensated liver cirrhosis.Cell Transplant，2010，19（4）:409-418.

［4］Tomasoni S，Longaretti L，Rota C，et al.Transfer of growth factor receptor mRNA via exosomes unravels the regenerative effect of mesenchymal stem cells.Stem Cells Dev，2013，22（5）: 772-780.

［5］孙艳，段芳龄，陈香宇，等.体外诱导人脐血间充质干细胞向肝细胞系细胞分化的研究.胃肠病学和肝病学杂志，2004，13（3）：239-243.

［6］Avital I，Inderbitzin D，Aoki T，et al.Isolation，characterization，and transplantation of bone marrow-derived hepatocyte stem cells.Biochem Biophys Res Commun，2001，288（1）:156-164.

［7］陈建锋，高毅，蒋泽生，等.人骨髓干细胞异体内诱导分化为肝细胞的实验.中国临床康复，2006，10（17）：164-167.

［8］戈霞晖，白冲.间充质干细胞发挥治疗作用的机制研究.广东医学，2010，31（20）：2725-2727.

［9］江敏华.间充质干细胞的免疫调控在治疗肝衰竭中的作用及机制探讨.苏州：苏州大学出版社，2011：312.

［10］Di Nicola M，Carlo-Stella C，Magni M，et al.Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli.Blood，2002，99 （10）:3838-3843.

［11］Jiang XX，Zhang Y，Liu B，et al.Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells.Blood，2005，105（10）:4120-4126.

［12］Yannaki E，Athanasiou E，Xagorari A，et al.G-CSF-primed hematopoietic stem cells or G-CSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury，predominantly by promoting endogenous repair programs.Exp Hematol，2005，33（1）: 108-119.

［13］Liu Y，Dulchavsky DS，Gao X，et al.Wound repair by bone marrow stromal cells through growth factor production.J Surg Res，2006，136（2）:336-341.

［14］Banas A，Teratani T，Yamamoto Y，et al.Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure.J Gastroenterol Hepatol，2009，24 （1）:70-77.

［15］Jimenez J J，Jy W，Mauro L M.Endothelial cells release phenotypically and quantitatively distinct microparticles in activa-tion and apoptosis.Thromb Res，2003，109（4）:175-180.

［16］Morel O，Toti F，Hugel B，et al.Cellular microparticles:a disseminated storage pool of bioactive vascular effectors.Curr Opin Hematol，2004，11（3）:156-164.

［17］Dean WL，Lee MJ，Cummins TD，et al.Proteomic and functional characterisation of platelet microparticle size classes.Thromb Haemost，2009，102（4）:711-718.

［18］Kim HS，Choi DY，Yun SJ，et al.Proteomic analysis of microvesicles derived from human mesenchymal stem cells.J Proteome Res，2012，11（2）:839-849.

［19］Sato T，Iso Y，Uyama T，et al.Coronary vein infusion of multipotent stromal cells from bone marrow preserves cardiac function in swine ischemic cardiomyopathy via enhanced neovascularization.Lab Invest，2011，91（4）:553-564.

［20］Camussi G，Deregibus MC，Bruno S，et al.Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.Kidney Int，2010，78（9）:838-848.

［21］Herrera MB，Fonsato V，Gatti S，et al.Human liver stem cellderived microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats.J Cell Mol Med，2010，14（6B）:1605-1618.

［22］Deregibus MC，Cantaluppi V，Calogero R，et al.Endothelial progenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA.Blood，2007，110（7）:2440-2448.

［23］Bruno S，Grange C，Deregibus MC，et al.Human mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.J Am Soc Nephrol，2009，20（5）:1053-1067.

［24］师玲玲.人类脐血间充质干细胞移植对急性肝坏死大鼠模型治疗作用的研究.广州：暨南大学出版社，2010：419.

［25］Bi B，Schmitt R，Israilova M，et al.Stromal cells protect against acutetubularinjuryviaanendocrineeffect.JAmSoc Nephrol，2007，18（9）:2486-2496.

［26］Parekkadan B，van Poll D，Suganuma K，et al.Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PLoS One，2007，2（9）:e941.

［27］Lai RC，Arslan F，Lee MM，et al.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem Cell Res，2010，4（3）:214-222.

［28］Reis LA，Borges FT，Simoes MJ，et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells repaired but did not prevent gentamicin-induced acute kidney injury through paracrine effects in rats.PLoS One，2012，7（9）:e44092.

［29］Bruno S，Grange C，Collino F，et al.Microvesicles derived from mesenchymal stem cells enhance survival in a lethal model of acute kidney injury.PLoS One，2012，7（3）:e33115.

［30］Gatti S，Bruno S，Deregibus MC，et al.Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant，2011，26（5）:1474-1483.

［31］Sokolova V，Ludwig AK，Hornung S，et al.Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.Colloids Surf B Biointerfaces，2011，87（1）:146-150.

［32］GholamrezanezhadA，MirpourS，BagheriM，etal.Invivo tracking of 111In-oxine labeled mesenchymal stem cells following infusion in patients with advanced cirrhosis.Nucl Med Biol，2011，38（7）:961-967.

［33］Chen TS，Lai RC，Lee MM，et al.Mesenchymal stem cell secretesmicroparticlesenrichedinpre-microRNAs.Nucleic Acids Res，2010，38（1）:215-224.

［34］Kunter U，Rong S，Boor P，et al.Mesenchymal stem cells prevent progressive experimental renal failure but maldifferentiate into glomerular adipocytes.J Am Soc Nephrol，2007，18（6）:1754-1764.

［35］Thirabanjasak D，Tantiwongse K，Thorner PS.Angiomyeloproliferative lesions following autologous stem cell therapy.J Am Soc Nephrol，2010，21（7）:1218-1222.

（收稿：2014-04-16）

（本文编辑：张骏飞）

第一作者：阮承兰，女，27岁，医学硕士，医师。E-mail：ruanchenglan@126.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.028

*基金项目：解放军第105医院院管课题［2013YG11］

作者单位：230601合肥市 安徽医科大学第二附属医院肝病科（阮承兰）；解放军第105医院感染病科（陈从新）

通讯作者：陈从新，E-mail：congxinc@aliyun.com

Application of mesenchymal stemcells and microvesicles in the treatment of patients with liver injuriesRuan Chenglan，ChenCongxin.DepartmentofInfectiousDiseases，105thHospital，AffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity，Hefei 230031，China

【Abstract】Transplantation of mesenchymal stem cells（MSCs）is an promising way in the treatment ofcirrhosis and liver failure.The possible mechanisms of MSCs in repair of liver injury are as follows：differentiation to hepatocyte-like cells，paracrine and immunomodulatory effects，and signal transmission mediated by microvesicles（MVs）.Results from present studies suggest that RNA carried by MVs has emerged as an important mechanism by which the stem cells may repair injured cells and MVs transplantation may become a new choice for improving decompensated liver functions.This review will discuss the possible mechanisms of intrahepatic transplanted MSCs and the potential of MVs in the treatment of liver injuries.

【Key words】Liver injury；Mesenchymal stem cells；Microvesicles；Treatment