黄瓜内生木霉菌对尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporum f.sp. cucumerinum)的抑制作用

贺字典,赵春明,谢新宇,殷领霞,2,孙艳红,周志广,任小芬

(1 河北科技师范学院生命科技学院，河北 秦皇岛，066600；2 赞黄中学；3 任丘市第二中学)



黄瓜内生木霉菌对尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)的抑制作用

贺字典1,赵春明1,谢新宇1,殷领霞1,2,孙艳红1,周志广3,任小芬3

(1 河北科技师范学院生命科技学院，河北 秦皇岛，066600；2 赞黄中学；3 任丘市第二中学)

采用内生菌常规分离法，对健康无病的黄瓜植株体内的内生真菌进行了分离筛选，将筛选出的10种内生木霉菌与黄瓜枯萎病菌对峙培养，编号为Th1402的木霉菌株抑菌率最高达77.59%。从中挑选出5种抑菌率较高的木霉菌株三三复配，挑取出亲和力最好的Th1401，Th1402，Th1403组合，进行固体发酵，在基础培养基与液体黄腐酸的质量比为20∶9时，木霉产孢量最高，达到6.25×108个/g。

内生木霉菌;抑菌率;固体发酵

内生菌(endophyte)是普遍存在于健康植物的根茎叶中，能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物[1]。许多报道已证明，在不同的植物体内都存在大量的内生菌。采用蔬菜内生微生物作为生防菌，因其本身就存在于蔬菜体内，容易占据有利的生防位置，可以经受住植物自身的防卫反应，与病菌直接相互作用，从而给植物提供全面有效的保护[2]。刘杰风等[3]从茄类蔬菜内生菌中分离出的芽孢杆菌株对青枯病菌的拮抗作用最强；苗则彦等[4]从黄瓜植株内分离出的细菌B504对黄瓜枯萎病具有一定防效；何红等[5]利用分离自辣椒叶片的内生枯草芽孢杆菌BS-2制成菌液，浸种处理后对黄瓜、甜瓜和番茄苗期立枯病有78.96%以上的抑制效果，并对这些蔬菜有较明显的促生作用；李萌等[6～7]研究分离自油菜茎的放线菌CHSH19A和银杏中的绿色木霉有极强的抗立枯丝核菌活性；王莉衡等[8]认为，从库拉索芦荟内生真菌内生哈茨木霉LH-7对供试植物病原真菌具有显著的抑制作用。但对蔬菜内生生防真菌的报道较少。本次研究主要研究了黄瓜植株体内分离的木霉真菌对黄瓜尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)的抑制作用，以期为蔬菜内生真菌生防制剂的制备提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试黄瓜品种：津春5号(引自天津农业科学院)、白叶三(引自天津市宝坻区蔬菜公司)、中农12(引自中国农业科学院)。

黄瓜枯萎病菌：尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum), 由本课题组鉴定并保存。

固体发酵培养基：体积分数0.90的液体黄腐酸(FA)由河北科技师范学院黄腐酸研究组惠赠，玉米粒，麸皮和小米均购自农贸市场。

1.2 内生真菌分离

内生真菌的分离：选取健康无病的苗期黄瓜植株，对其根部和茎部按常规无菌操作进行内生真菌的分离[9，10]。将采集来的新鲜黄瓜茎和根用自来水冲洗干净后，用无菌滤纸吸干水分，将茎和根分别切成1 cm的小段，在体积分数为0.75的乙醇中浸泡5 min，再用体积分数为0.02的次氯酸钠消毒5 min，用无菌水冲洗3～5次，于灭菌的研钵中碾磨成匀浆，取匀浆上清液涂于含有40 mg/L的链霉素PDA平板上，置于28 ℃恒温箱中培养，重复3次。以最后一次无菌水洗液涂于PDA平板上作为对照。根据菌落形态、颜色等挑取不同菌落，纯化后保存，供拮抗真菌的筛选。

1.3 拮抗真菌的筛选

将分离得到的内生木霉菌，经单孢分离纯化后，分别与黄瓜枯萎病原真菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)对峙培养于PDA平板上，2菌株间距为5 cm，设置3次重复，分别以内生真菌和黄瓜尖孢镰孢菌在PDA上纯培养做对照。每隔24 h测量半径并按照下面的公式计算抑菌率。

抑菌率= [(R-Rck)/R]×100%

其中，R为对照组中接种的病菌菌落平均生长半径(cm)，Rck为对峙组中接种的病菌菌落平均生长半径(cm)。

1.4 木霉菌株间亲和力测定及最佳组合菌株筛选

将以上10种木霉菌(编号为Th1401～Th1410)三三组合在PDA平板上对峙培养，25 ℃培养5 d，以单菌的对峙培养做亲和对照。一般2个菌落环之间的抑菌带越窄或是不明显则确定为亲和力较优，反之则说明2种菌株亲和力较差。以此为依据，筛选出亲和力最佳的组合，并对其进行固体培养。

1.5 拮抗木霉菌的鉴定

将纯化好的木霉菌株进行单孢分离后，接种到PDA培养基上，按照文献[11～14]观察并记载菌落特征，如菌丝层薄厚、疏密、生长速度、有无色素产生、有无气味等，同时用接种针挑取不同部位的菌丝体制成玻片，置于光学显微镜下观察分生孢子大小和形态、分生孢子梗分枝方式和形态、瓶梗的形态及着生方式、菌落表面分生孢子簇的形状，将木霉菌鉴定到种。

1.6 培养基制备

1.6.1 基础固体培养基 将200 g煮熟的玉米粒放入罐头瓶中，灭菌(在高压锅中121 ℃湿热灭菌30 min)，自然冷却，每瓶接混合木霉孢子悬浮液2 mL(含分生孢子1×1010个/L)，搅拌均匀，8层纱布封口，每个处理重复3次(作为ck)。28 ℃黑暗培养7 d，培养过程中不再加水，每隔2 d摇晃1次。

1.6.2 组合培养基 以玉米粒培养基为基础培养基，向内加入不同比例的黄腐酸、麦麸、小米，组合成含有不同营养成分的培养基(表1)。每种组合都设置3次重复，培养基的接菌量均为2 mL混合木霉孢子悬浮液(内含分生孢子1×1010个/L)，培养时间为7 d，培养条件为28 ℃的培养箱中无光照不再加水，每隔2 d摇晃1次。

表1 组合培养基成分比例

2 结果与分析

2.1 拮抗木霉菌株的筛选

内生木霉菌对黄瓜尖孢镰孢菌的抑菌率很有规律，随着时间的延长其抑菌率越来越高，说明所筛选出的内生木霉菌对黄瓜尖孢镰孢菌都具有一定的抑制作用(图1)。经过48 h对峙培养，大部分对峙培养中的木霉菌和黄瓜尖孢镰孢菌的菌落已相互接触，随着时间的延长，病原菌受到明显的抑制，内生真菌开始包围或覆盖或产生抑菌带抑制病菌菌落的生长。10种木霉菌对黄瓜尖孢镰孢菌的抑制效果均不同(图2～图11)。

Th1402抑菌率最高，达77.59%；其次为Th1403，抑菌率达76.72%；Th1401抑菌率达75.53%；木霉Th1404抑菌率为75.12%；木霉Th1406抑菌率为74.16%；其余的抑菌率均低于70%。由此挑选出抑菌率较高的Th1402，Th1403，Th1401，Th1404，Th1406作为下一步的木霉复配亲和力测定菌株(表2)。

2.2 拮抗木霉菌之间亲和力的测定

木霉菌的组合中，Th1401，Th1402，Th1403组合的3个菌落之间几乎无抑菌带存在，说明Th1401，Th1402，Th1403之间的亲和力最佳(图12)。TH1402，Th1403，Th1406组合和TH1402，Th1404，Th1406组合中都由于TH1402与Th1404之间的抑菌带较宽所以被淘汰。

图1 黄瓜内生木霉菌对峙黄瓜尖孢镰孢菌24～120 h抑菌率

表2 内生木霉菌对黄瓜尖孢镰孢菌的抑菌率(28 ℃培养5 d)

木霉菌株抑菌率/%Th1402Th1403Th1401Th1404Th1406Th1408Th1405Th1410Th1407Th140977.59±1.35aA76.72±2.73bA75.53±1.31cB75.12±0.90cB74.16±2.16dC67.87±5.36eD66.83±3.55fE66.41±1.34fgE66.06±5.36gE57.27±3.37hF

注：表中小写字母表示数据间在5%水平上的差异性，大写字母表示1%水平上的差异性，下同。

3 木霉种的鉴定

经过形态学鉴定，Th1401，Th1403，Th1404为哈茨木霉(TrichodermaharzianumRifai)；Th1402，Th1406为深绿木霉(TrichodermaatrovirideBissett)；Th1405为棘孢木霉(TrichodermaasperellumSamuels)。

4 固体发酵组合培养基筛选

通过试验筛选出固体发酵培养基最佳组合配方为：m(基础培养基)∶m(液体FA)=20∶9，产孢量最高，达6.4×108个/g，产孢量显著高于基础培养基+麦麸组合和ck，极显著高于基础培养基+小米组合。而基础培养基+麦麸组合与ck之间产孢量不存在显著差异(表3)。

图12 组合木霉菌株间亲和力测定(上图为正面，下图为背面)

培养基组合质量比产孢量/(×108个·g-1)m(基础培养基)∶m(液体FA)m(基础培养基)∶m(麦麸)m(基础培养基)∶m(小米)m(基础培养基)(ck)20∶920∶320∶1 6.4aA3.9bB2.7cB3.2bB

4 结论与讨论

姚振[15]研究发现，内蒙古产及江西产仙鹤草内生真菌菌株中有6株内生真菌菌株发酵产物具有较强的抗氧化活性，25株内生真菌菌株发酵产物能抑制胃癌细胞SGC的增殖，10株内生真菌菌株发酵产物对结肠癌细胞LOVO的增殖有一定的抑制作用。鲁海菊等[16]研究发现，枇杷各个器官中的内生真菌对P3.9生防木霉菌株无抑制作用的占93.8%,有一定抑制作用的仅占6.2%，而且对其抑制率均在50%以下。说明此菌株有望在枇杷各器官中成功定殖，从而有效控制枇杷根腐病病菌。为确保所分离到的微生物为黄瓜内生真菌，本次研究采用的表面消毒比一般组织培养消毒更为严格，并对所消毒材料冲洗后的无菌水进行涂板培养，如在3～4 d内没有菌落产生，则认为该材料消毒彻底，证明所分离到的为内生真菌。经分离筛选出10种内生木霉菌，再与黄瓜枯萎病原真菌对峙培养，结果表明，编号为Th1401，Th1402，Th1403，Th1404，Th1406的木霉菌株拮抗作用尤为显著，其抑菌率在77.59%～74.16%之间，可选为防治黄瓜枯萎病最具潜力的生防菌。然后将这5种木霉菌的三三复配，通过亲和力的测定，筛选出亲和力最佳木霉菌组合(Th1401，Th1402，Th1403组合)，可利用木霉不同菌种对病原真菌多种拮抗机制(有竞争作用，溶菌作用，抗生作用，重寄生作用以及产生胞外水解酶等，进一步研究)以便达到更高的防治效果。对于筛出的最佳内生木霉菌株Th1401，Th1402，Th1403组合进行发酵时，优选选择固体发酵，因其生产成本低，产生的分生孢子具有较高的质量。本次试验中所选出的最佳固体组合培养基为玉米粒+液体黄腐酸，其产孢量最高达6.4×108个/g，比玉米粒培养基(ck)的产孢量增加了1倍，原因是黄腐酸具有弱酸性、吸水性、吸附性、离子交换性、氧化还原性及提高酶活性等，并且黄腐酸的弱酸性利于木霉菌株生长及产孢[17]。但是，与王英姿等[18]对于室内固体培养基筛选出的配方：玉米碎粒、稻壳、麸皮、脲的质量比2∶3∶1∶2时，绿色木霉孢子量最高可达9.9×1010个/g相比较，本试验所得结果并未提高，还有待于下一步研究。

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(责任编辑：朱宝昌)

Inhibition Effect of EndophyticTrichodermaSeparated From Cucumber toFusariumoxysporumf.sp.cucumerinum

HE Zi-dian1,ZHAO Chun-ming1,XIE Xin-yu1, YIN Ling-xia1,2, SUN Yan-hong1,ZHOU Zhi-guang3,REN Xiao-fen3

(1 College of Life Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology，Qinhuangdao Hebei,066600；2 Zanhuang Middle School；3 Renqiu Second School;China)

EndophyticTrichodermafrom healthy cucumber, belongs to 3 species, was isolated and identified by the usual methods. The results showed that the inhibition rate ofTrichodermaTh1402 toFusariumoxysporumf.sp.cucumerinumwas 77.59%, which was the highest in all strains. Three strains Th1401, Th1402, Th1403, the best combination, were chosen to germinate on the solid medium. The sporulation quantities was the highest, 6.25×108/g on the corn plus FA.

endophyteTrichoderma;inhibition rate;solid fermentation

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.001

贺字典( 1972-) ，博士，教授。主要研究方向: 蔬菜病害生物防治。

河北省自然科学基金项目(项目编号：C2013407108)，河北省教育厅重点课题(课题编号：ZD20131041)，秦皇岛市科技支撑计划项目(项目编号：201402B028)。

2014-09-10; 修改稿收到日期: 2015-01-30

S436.421.1

A

1672-7983(2015)01-0001-05