响应曲面法优化附子多糖的微波提取工艺

朱盛林 郑玲利 袁明勇 赵 霞

成都医学院第一附属医院药剂科，四川成都 610500

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，中药中“回阳救逆第一品”。 附子中的主要化学成分有生物碱、多糖、苷类、甾醇、无机盐等。研究表明，中药多糖具有免疫调节[1]、抗肿瘤、抗感染、抗病毒、抗氧化[2-3]、抗辐射、降血糖、降血脂[4]、保肝等多种药理作用。 附子多糖无明显毒性，其低毒性已受到人们的重视[5]。

作为水溶性化合物， 附子多糖是中药临床使用中较大量的成分，因此，对其提取方法及含量的研究有重要意义。传统的附子多糖的提取工艺研究，均采用煎煮方法[6-7]，可能会导致多糖部分水解。而微波辅助法提取多糖，可以缩短实验和生产时间，同时还可以提高提取率及产品纯度，并且节省溶剂。本试验首次采用微波辅助提取法进行附子多糖的提取[8-9]，运用响应面法[10]确定提取时间，提取温度和料液比对于附子多糖提取率的影响， 以获得附子多糖提取最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料

调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）、循环式真空水泵（巩义市予华仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）、离心机（上海安亭科学仪器制造厂）；紫外可见光光度计UV-1100 型（上海美谱达仪器有限公司）等。 附子购于四川江油（批号：20140219）、无水乙醇（批号：20130102）、苯酚（批号：20140221）、浓硫酸（批号：20130817）、三氯甲烷（批号：20131013）、正丁醇（批号：20131025）、蒸馏水，无水葡萄糖 （批号：20140228）、 邻苯三酚 （批号：20130822）、 稀盐酸 （批号：20140418）、Tris （批号：20140308）等为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 粗多糖提取 附子用自来水清洗干净，用蒸馏水漂洗2 次，烘干至恒重，粉碎过60 目筛，备用。取干燥的附子粉5 g，加入适量80%乙醇回流3 h 脱脂，抽滤，药渣挥尽乙醇。 脱脂后药渣浸泡于蒸馏水中30 min，放入微波炉中提取，浓缩提取液为20 mL，加入无水乙醇配置为80%的乙醇溶液，于4℃冰箱内放置12 h后取出，4000 r/min 离心5 min。 弃上清液，依次用无水乙醇、乙醚清洗沉淀，得到粗多糖。

1.2.2 标准曲线的绘制

1.2.2.1 90%苯酚液的配制 准确移取苯酚90 mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90%苯酚液。

1.2.2.2 6%苯酚液的配制 将90%苯酚液稀释至6%，现配现用。

1.2.2.3 绘制曲线 分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的0.1 mg/mL 的葡萄糖标准液， 置于10 mL 试管中，各加水补足至2 mL，加入6%苯酚1 mL摇匀，迅速滴加浓硫酸5 mL 放置5 min，置沸水浴中加热20 min， 迅速冷却至室温， 于490 nm 处测吸光度。葡萄糖浓度为横坐标X（μg/mL），吸光度为纵坐标Y，绘制标准曲线。

1.3 附子多糖含量测定

将提取得到的多糖20 mg 用蒸馏水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液0.2 mL，加蒸馏水1.8 mL，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度[11-13]。含量（%）=（CDf/W）×100%（C 为样品液中葡萄糖的浓度，单位为mg/mL；D 为稀释因素；f 为换算因子，单位为/mL；W 为样品质量，单位为mg。 得到f=1.71）。

1.4 单因素试验

分别考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取温度（60、70、80、90℃）及提取时间（5、10、15、20 min、）对附子多糖提取率的影响。

1.5 响应曲面试验设计

在单因素试验结果基础上，选取单因素试验3 个因素中的各3 个水平。利用Design-Expert 软件进行响应曲面分析（RSM），进行Box-Behnken 设计。 编码表如表1 所示。 采用SAS 对试验数据进行回归分析[14]。求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，对微波辅助提取附子多糖的影响因素进行筛选，并做出响应面图，建模及分析。

表1 响应曲面试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以吸光度为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线， 由试验结果得出回归标准曲线方程：A=5.9508C+0.0002，R=0.9999。 葡萄糖标准品在 （0～0.16）mg/mL 范围内呈良好线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 时间对附子多糖提取率的影响

料液比为1∶5， 温度70℃， 设置提取时间分别为5、10、15、20 min， 考察提取时间对多糖提取率的影响，从图1 中可以看出，附子多糖提取率随着提取时间的增加而增高，当提取时间增加到20 min 时，多糖的提取率下降，可能是因为时间过久，多糖发生降解。

图1 提取时间对附子多糖提取率的影响

2.2.2 温度对附子多糖提取率的影响

提取时间为10 min，料液比为1∶20，温度分别设置为60、70、80、90℃， 考察温度对附子多糖提取率的影响，从图2 中可以看出，在提取时间、料液比一定的前提下，附子多糖提取率随着温度的增加而增高。 当温度超过80℃时，提取率略微降低，因高温可能对多糖的结构和活性有一定影响。

图2 温度对附子多糖提取率的影响

2.2.3 料液比对附子多糖提取率的影响

温度为70℃，时间为10 min，设置料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，考察料液比对附子多糖提取率的影响，从图3 中可知随料液比的加大， 提取率逐渐提高，超过1∶20 时，提取率趋于稳定。

2.3 响应曲面试验设计结果

根据单因素试验结果，选取提取时间、提取次数和料液比3 个因素设计响应面试验，研究3 个因素不同组合对多糖提取率的影响。试验因素和水平及试验结果见表2。

图3 料液比对附子多糖提取率的影响

表2 附子多糖提取响应曲面设计试验及结果

2.4 响应面分析拟合回归方程的方差分析

以附子多糖提取率为响应值，利用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析， 各因素经回归拟合后， 得到回归方程：Y=16.72+0.38A-0.31B-0.26C-0.24AB-0.035AC-0.47BC-2.27A2-1.32B2-2.01C2。运用所建立的数学模型结果进行方差分析，回归方程模型的F 值为27.15，P 值为0.0001，表明模型是非常显著的。 失拟项不显著（P=0.8866），说明该模型是合理的，可以进行下一步的分析预测。 由P 值可知，在实验范围内3 个因素对提取率影响的大小顺序为： 料液比＞提取时间＞温度。 A、C、BC、A2、和C2对多糖提取率的影响显著（P ＜0.05）。 A、B、C 的交互作用大小为AC＞BC＞AB，R2=0.9467，则证明该模型可以解释响应值的变化有94.67%来源于所选变量即提取时间、 提取温度、料液比，自变量与响应值之间有相互的对应关系，说明该模型拟合程度较好，可以用来分析和预测多糖提取率。 回归分析结果见表3。

2.5 响应曲面图形分析

Design-Expert 软件处理得响应面三维图形见图4～6。 根据所得模型可以看出，随着料液比的增加，提取率逐渐增加， 但料液比在达到一定值后开始下降，而提取时间先降低后升高， 通过分析得到最优工艺参数：提取时间10.45 min，提取温度78.85 ℃，料液比1∶19.74。 在此条件下附子多糖的提取率为16.79%。

表3 响应面分析拟合回归方程的方差分析

图4 提取温度与料液比对附子多糖提取率的影响

图5 提取时间与料液比对附子多糖提取率的影响

图6 提取时间与提取温度对附子多糖提取率的影响

2.6 最优工艺条件的确定及验证

通过Design-Expert 确定最佳工艺条件为： 提取时间10.45 min，提取温度78.85 ℃，料液比1∶19.74。在这样的工艺条件，总黄酮提取率的理论值为16.79%。根据仪器及实验条件，选取提取时间为10 min，提取温度为80℃，料液比1∶20，进行重复验证试验，得到附子多糖提取率为16.10%，与理论值相对吻合，证明响应面法得到的提取参数可靠。

3 讨论

借助微波技术，通过响应面分析法对附子多糖提取工艺进行优化，建立了附子多糖提取率的二次多项数学模型，模型显著，拟合情况良好。各因素对附子多糖提取率的影响次序为： 料液比＞提取时间＞温度；最优工艺参数：提取时间10 min，提取温度80℃，料液比为1∶20，提取率为16.10%，大大优于传统的煎煮提取方法，是一种很好的提取附子多糖的工艺条件。 通过响应面优化法可以确定各因素及其交互作用在工艺过程中对响应值的影响，精确表达因素和响应值之间的关系，并为寻找最优工艺条件并降低开发的时间和成本。 此外，微波提取工艺能有效降低工艺条件的复杂性，而且消耗的能源和时间也较少，为附子综合利用和附子多糖的产业化提供理论指导。 接下来，本研究组将对采用该方法提取得到的附子多糖的结构及活性做进一步的研究，以丰富附子水溶性成分的药理结果。

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