软骨损伤动物模型的建立及分析方法

吴 宁 刘 武

（广西中医药大学，广西 南宁530001）

软骨损伤动物模型的建立及分析方法

吴 宁 刘 武

（广西中医药大学，广西 南宁530001）

目的：总结软骨损伤动物模型的建立及分析方法。方法：查阅软骨损伤动物模型的建立及分析方法的相关文献。结果：软骨损伤动物模型的建立主要从动物的选择、损伤部位、损伤方法以及损伤后的软骨分析等方面考虑，经过分析得出最符合人类急性应力损伤的造模方法，即撞击法。结论：软骨损伤动物模型的建立及分析方法很多，效果及应用各异。软骨损伤动物模型的损伤机制与人类之损伤机制越相似，治疗及相关研究就越有价值。由于撞击法模拟人类软骨急性损伤机制，因此撞击法建立软骨损伤动物模型备受重视。

软骨损伤；动物模型；方法

人体机能水平随年龄增加呈抛物线样改变，由于运动、劳累、负重以及关节长期过度体位负荷等因素，关节软骨不可避免损伤退变。常见软骨损伤不外乎慢性劳损退变及急性应力损伤两类。关节软骨慢性劳损退变过程漫长，因素复杂，动物研究困难，因此临床常研究急性应力导致的软骨损伤。建立软骨损伤动物模型涉及动物的选择、损伤方法、关节部位、软骨损伤分析等各个方面。本文将分别从这几方面对软骨损伤的动物造模进行综述。

1 动物的选择

关于动物软骨损伤造模选择的动物有牛、狗、兔、鼠等。张胜等[1]用离体新鲜牛肩关节软骨组织块建立软骨损伤模型研究撞击应力与软骨损伤之间的关系，发现从5 MPa 应力开始,软骨细胞死亡比例与正常组比较有统计学差别，应力负荷引起关节软骨的损伤与负荷加载速率有关，急性应力负荷易损伤软骨基质, 慢性应力负荷易损伤软骨细胞。陈琦等[2]用活体牛建立膝关节软骨损伤模型进行不同射频能量处理研究，发现70W的双极射频能量处理即可使软骨表面足够光滑。Mrosek EH等[3]用狗膝关节建立软骨损伤模型进行免疫组化分析软骨损伤，证实了软骨下骨损伤可导致软骨基质退变，有学者运用狗膝关节软骨损伤模型研究骨软骨变性[4]。胡炯等[5]选择新西兰兔建立关节软骨病变的动物模型。王东明等[6]选择兔来建立钝性软骨挫伤模型，发现软骨病变与时间、撞击次数成正比关系。马文明等[7]研究发现大鼠的前交叉韧带切断加内侧半月板切除10周后可出现软骨损伤，选择大鼠制作软骨损伤模型可行。牛、狗、猴等费用高，操作相对困难，实验适用度低，不宜用于普遍动物模型研究；兔、鼠是目前普遍选用的动物，适合各种模型研究。

2 造模部位

膝关节为重要的负重关节，此部位的软骨损伤最为普遍，当然也有髋关节软骨损伤的研究。王志岩等[8]选择兔髋臼软骨建立冲击伤模型，并进行冲击能的量化研究，发现质量为0.4kg 的重锤从高 35cm处垂直开放性冲击，软骨所受总冲力平均值为 203.910N；从 15cm 处冲击软骨所受冲力平均值为105.919N。Newberry等[9]选择兔膝关节通过闭合撞击建立软骨损伤模型，研究高能量及低能量撞击下软骨退变情况，发现撞击力大，软骨损伤程度重，膝关节退变也严重。Vrahas等[10]选择兔股骨髁运用自制冲击器进行开放性坠落撞击法建立软骨损伤模型，量化了冲击能与软骨损伤程度之间的关系。Mrosek等[3]选择比格犬膝关节，运用带透视成像的自由坠落撞击装置闭合撞击的方法建立软骨损伤模型，通过免疫荧光检验法分析了解损伤软骨退变过程。其它关节的软骨损伤比较少见，鲜有研究。

3 软骨损伤造模方法

3.1 化学损伤造模方法

化学方法主要是通过关节腔药物注射引起软骨损伤。杨峰等[11]在兔颞颌关节上腔注射 0.3ml 1.6 %木瓜蛋白酶溶液，阶段性切取关节软骨做大体及组织病理学观察，发现关节软骨变薄、基质分解破坏等退行性改变。Yeh等[12]在关节注射胶原酶后观察发现用药早期关节软骨损伤破坏，晚期发生退变。可以引起软骨损伤的药物还有碘乙酸盐、透明质酸酶、软骨微粒、菲律宾菌素、肾上腺皮质激素等，采用化学方法可用建立软骨损伤退变动物模型，但不能模拟急性应力软骨损伤。

3.2 物理损伤造模方法

人类急性应力软骨损伤常由碰撞引起，如高处落地引起骨与骨之间的碰撞，关节与外硬物的接触碰撞等，软骨损伤动物模型的损伤机制与人类之损伤机制越相似，治疗及相关研究就越有价值。软骨损伤动物模型中的物理损伤方法很多，梁佩红等[13]用电动骨钻在兔股骨髁关节面部位造成直径4.5mm，深度为3mm的关节软骨缺损的单纯手术钻孔方法，建立了一个较理想的兔膝关节软骨缺损动物模型。黎健伟等[14]用牙科钻在兔膝关节股骨髁关节面打造直径4mm，深度约3mm的圆形孔，术后加伸直位固定12周，建立了膝关节陈旧性软骨缺损模型。Mastbergen等[15]通过手术行不伤及软骨下骨的软骨表面刮痕建立犬软骨损伤模型。此外，物理损伤方法有单纯关节制动[16]、手术切除关节韧带等破坏关节稳定性、血液循环阻碍、撞击法等。邵世坤等[17]用击锤直接开放性撞击兔膝关节股骨内侧髁软骨面的方法致软骨损伤，研究软骨损伤后的退变过程，研究表明0.9J能量撞击后软骨早期Mankin评分与对照组有显著性差异，4周后无差异性；6.3J能量撞击后软骨Mankin评分始终高于对照组，差异性随时间逐渐增大。Mrosek等[3]通过闭合性撞击犬膝关节建立软骨损伤模型。撞击法软骨损伤即模拟人类损伤机制，因此撞击法建立软骨损伤动物模型备受重视。

4 模型软骨损伤的相关分析

4.1 损伤负荷的分析

撞击法致软骨损伤造模需要选择合适的应力负荷，负荷太小，无法损伤软骨，或者仅造成轻微损伤，数日便可自愈；负荷太大，致使关节粉碎。不同动物的软骨所能承受的应力负荷不同。Borrelli等[18]研究开放性撞击牛软骨损伤模型，证实25N/mm2（25Mpa）的冲击力将引起软骨细胞死亡；Thompson等[19]用 2170N 冲击损伤犬髌股关节，发现软骨下骨和钙化带有骨折移位，电镜显示关节面裂隙改变；Lahm等[20]研究发现犬髌股关节在1800N～2500N（平均大约2100N）的冲击力下，可造成软骨下骨损伤而不损伤关节软骨面；邵世坤等[21]通过开放性坠落撞击兔膝关节股骨滑车软骨面，证实了6.3J能量撞击可以造成胶原纤维网架断裂及变形，软骨外观完整，此类损伤后关节软骨不能自行修复,并随时间增加软骨退变越明显；Ronsky等[22]通过压力敏感性胶片试验显示人关节的正常应力在5-10MPa范围内。大鼠动物软骨所能承受的应力负荷大小尚无研究，我们可以参考以上已有研究，通过各种应力负荷损伤软骨，或可摸索出不同动物软骨所能承受的应力大小。

4.2 损伤后的组织学免疫学分析

如何知道不同的应力下软骨损伤的程度？常用方法是软骨切片染色显微观察，损伤程度包括软骨细胞损伤、软骨有裂痕、胶原网架断裂。研究发现此类程度损伤的软骨不可自愈，并逐渐退变，损伤呈持续性加重[23]。卫小春等[24]探讨不同染色方法对大鼠膝关节软骨染色的优缺点，发现番红O染色显示软骨各层和潮线结构最佳，苏木精-伊红染色观察软骨细胞形态变化较其他染色方法清楚；张胜等[1]通过FDA/PI双荧光染色法观察软骨细胞损伤的程度及分布模式，使用扫描电镜观察网状胶原结构以及采用改良的阿新蓝染液法测定基质损伤程度；姜铃霞等[25]研究发现动物血清中BMP-2、CTX-Ⅱ、COMP 的含量能间接反映各期软骨损伤的程度，软骨切片行HE 染色后光镜观察，采用Mankin评分评估软骨损伤程度；王东明等[6]选择HE染色，番红O染色，按Mankin评分法评分，II型胶原免疫组化检测，II型胶原原位杂交，透射电镜观察等分析钝性挫伤后兔关节软骨的变化。组织学免疫学的主要观察手段是通过各种化学染色及免疫杂交观察组织细胞的形态和结构的完整性。我们通常运用组织学方法观察软骨损伤程度，具体操作步骤：采集标本→福尔马林溶液固定→EDTA溶液脱钙→脱水、浸蜡、包埋后切片→HE染色及番红O染色等特殊染色→宏观及显微观察。由于只有软骨损伤致胶原网架断裂才失去自愈能力[23]，所以我们可以通过观察软骨损伤程度选择合适的冲击力建立软骨损伤动物模型，反之，又可以研究不同的冲击力对软骨的损伤程度。

4.3 生物力学分析

研究表明由于关节软骨本身的特性，软骨损伤退变后，其生物力学会改变，原有的生物力学功能很难被修复，目前尚无很好的治疗方法[26]。生物力学观察内容包括组织弹性及耐久性。传统软骨生物力学研究多集中在单细胞整体平均力学特性的分析上，其常用的研究方法如微管吸吮法[27]，无法在细胞自然生活状态下进行力学检测，也不能提供细胞不同区域和部位更加精确的力学特性。刘广源等[28]研究发现可以运用原子力显微术磁驱动模式(MAC mode AFM)检测细胞不同区域的弹性和粘滞性等力学特性，弥补了传统法的不足。

4.4 软骨损伤MRI分析

因MRI组织对比性强，空间分辨率高，可进行多序列、多参数和多方位的采样，在显示软骨组织方面，X线平片和CT是难以比拟的，临床常用MRI辅助检查患者关节软骨情况。王志岩等[8]研究MRI影像学观察冲击伤后软骨损伤程度，证实了MRI诊断早期软骨损伤具有可行性，并与组织病理学进行比较，认为当软骨基质、蛋白多糖和含水量的改变足以引起信号改变时，MRI 诊断软骨损伤的敏感性和正确性与组织病理学一致，否则对软骨损伤的分析判断力不如组织病理学。Graichen等[29]研究表明 MRI 常规序列不能敏感和清晰的显示关节软骨，而王志岩的研究认为T2*/C/RF-FAST/VOL和T2*/T/FE/MTC/MAST在软骨损伤的诊断中，敏感度分别为 92%和 91%，特异度为 95%和 93%，应作为关节软骨检查的最佳扫描序列；T1/C/FSE /C+造影序列在诊断软骨损伤中，敏感度为 89%，特异度为 92%，可清晰显示关节软骨表面，尤其对软骨缺损的诊断更为敏感。

5 结语

软骨损伤动物模型研究方法各有不同，但主线大同小异，一是选择损伤方法；二是选择损伤部位；三是对损伤部位进行分析，筛选出模型；四是对模型进行药物研究，最后甚至可以进行药理机制研究。

通过软骨损伤相关文献了解，认为撞击法软骨损伤最符合人类急性应力损伤机制，钻孔、刮痕、关节固定及药物注射等方法所导致的软骨损伤在人类软骨损伤中较为少见。撞击法中开放性直接撞击虽然可以量化冲击能与软骨损伤程度之间的关系，但是手术损伤关节周围组织结构，疤痕组织或感染等影响关节活动，由此方法建立的软骨损伤动物模型影响后期的关节退变及药物治疗研究，当然，此方法可用于研究术后合并或造成软骨损伤的患者。闭合性撞击恰好可以避免开放性撞击所造成的影响，且人类软骨损伤也常是闭合性的。因此，若单纯研究软骨的即时损伤机制及量化冲击能，选择开放性撞击法比较适宜；若合并研究软骨损伤后软骨退变及药物治疗情况，选择闭合性撞击法为佳。

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Methods to analysis and establish the animal model of articular cartilage injury

Objective:To review the methods to analysis and establish the animal model of articular cartilage injury. Methods:Recent literatures about the method of analyzing and establishing cartilage injury animal model were reviewed. Results:Methods to establish the animal model of cartilage damage mainly from aspects of animal selection, site of injury, means of injury and analysis of cartilage damage considering, the molding method of the most consistent with human acute stress damage, namely the impact method. Conclusion:A lot of methods to selection to analysis and establish the cartilage injury animal model ,which application and effect is different. Injury mechanism of human and injury mechanism of animal models of cartilage injury more similar, treatment and related research is more valuable. Because the impact method to simulate human acute osteochondral injury mechanism, thus it will be pay more and more attention to establish animal model of cartilage injury.

Cartilage injury; animal model; method

R-33

A

1008-1151(2015)01-0105-03

2014-12-15

吴宁（1986－），男，广西玉林人，广西中医药大学2012级中医骨伤专业硕士研究生，从事关节创伤及韧带修复方向研究。