苦荞提取物中槲皮素在糖尿病大鼠体内的药动学研究

袁铭兰，田玉芳，孙 晨

苦荞为蓼科荞麦属植物苦荞麦Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn .的干燥成熟种子[1]。近年来，随着药食两用资源的不断开发，有关苦荞的研究逐渐增多。苦荞富含芦丁、山萘酚、山萘酚-3-O-芸香糖苷及槲皮素等黄酮类化合物[1]，现代药理研究其具有降糖降脂抗氧化等作用[2,3]。槲皮素是苦荞中主要的黄酮成分之一，关于槲皮素单体的药动学研究已有报道[4,5]，但有关苦荞提取物中槲皮素的药动学及在病理状态下的药动学尚未见报道。本实验对苦荞提取物中槲皮素在正常大鼠及糖尿病大鼠体内的药动学进行了研究，以期对含苦荞的药品及保健食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪（包括SPD-20A紫外检测器，N2000色谱工作站）；高速离心机（美国Sigma公司）；METTLER AE240分析天平（梅特勒仪器有限公司）；SK-1快速混匀器（江苏金坛中大仪器厂）。

槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406）；苦荞提取物（自制，HPLC法测得槲皮素含量为31.46 mg/g）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国天地试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团），其余试剂均为分析纯。

雄性SD大鼠[江苏大学动物实验中心，合格证号：SCXK（苏）2009-0002]15只，平均体重（250±20）g。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（250×4.6 mm，5 µm）；流动相：0.2%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）按如下梯度洗脱：0～20 min，25%～40% B；20～23 min，40%～50% B；23～35 min，50%～75% B；流速：1 ml/min；检测波长：370 nm；柱温30 ℃；进样20 µl。

1.2.2 苦荞提取物的制备 称取干燥的苦荞粉末50 g，置1 L烧瓶中加入10倍量70%乙醇，加热回流提取2次，每次1 h，过滤，滤渣用70%乙醇润洗，合并滤液，浓缩并干燥即得，经HPLC测得苦荞提取物中槲皮素含量为31.46 mg/g。

1.2.3 对照品溶液的配制 精密称取槲皮素对照品适量置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得含槲皮素68.4 mg/L的对照品溶液。

1.2.4 血浆样品预处理 精密吸取血浆0.1 ml，加0.2 ml乙腈沉淀蛋白，涡流振荡1 min，13 000 r/min，离心5 min，取上清0.45 μm微孔滤膜滤过，进样20 μl。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 方法的专属性 将空白血浆、空白血浆中加入槲皮素对照品、灌胃苦荞提取物后正常大鼠血浆样品及灌胃苦荞提取物后糖尿病大鼠血浆样品按“1.2.1”项下进样，考察槲皮素主峰的特异性，是否与其他峰分离度良好。

1.2.5.2 线性范围及检测限 精密吸取槲皮素对照品溶液适量，置于1 ml离心管中，加入大鼠空白血浆100 µl，配制成槲皮素浓度为0.171、0.342、0.684、1.710、3.420、6.840 mg/L的血浆样本，并进行色谱分析，以峰面积Y对血药浓度X进行线性回归。

1.2.5.3 准确度和精密度 配制含槲皮素0.285、0.855、3.420 mg/L的低、中、高浓度的血浆样品，各浓度测5次，连续测定5 d，计算槲皮素的含量，求算方法的准确度和精密度。

1.2.5.4 提取回收率 配制含槲皮素0.285、0.855、3.420 mg/L的低、中、高浓度的血浆样品各5份，进样20 μl，测定得到峰面积（5次测定的平均值）A1；以同时配制等浓度的对照品溶液进样得到的峰面积（5次测定的平均值）A2作为对照，计算得出低、中、高3个质量浓度的血浆样品中槲皮素的提取回收率（R=A1/ A2×100%）。

1.2.5.5 稳定性考察 配制含槲皮素的低、中、高3个浓度0.285、0.855、3.420 mg/L的血浆样品，考察室温放置稳定性、临时储存稳定性及长期储存稳定性。

1.2.6 药动学研究 将15只平均体重为（250±20）g的雄性SD大鼠分为2组，其中模型组10只，对照组5只。适应性饲养3 d后，禁食1夜。模型组雄性SD大鼠10只高脂高糖饲料喂养2周后，一次性腹腔注射35 mg/kg STZ（溶于0.1 mol/L的枸橼酸缓冲液中，pH 4.5）造糖尿病模型，对照组注射同体积的枸橼酸缓冲液。48 h后大鼠禁食12 h，测定空腹血糖，取5只血糖高于14 mol/L的模型组大鼠用于实验研究[6]。将模型组和对照组大鼠同等条件下饲养4周。将饲养4周的模型组和对照组大鼠（于实验前3 d重新测定血糖）给药前禁食12 h，自由饮水，两组大鼠灌胃给药苦荞提取物0.5 g/kg（给药剂量按槲皮素算为15.73 mg/kg），并于给药前及给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h眼眶后静脉丛取血，置于肝素化离心管中，分离血浆，-20℃保存。

1.3 统计学处理 血药浓度数据采用3P97软件进行处理，其余数据采用DAS 2.0统计软件进行处理，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 方法的专属性 空白血浆、空白血浆中加入槲皮素对照品、灌胃苦荞提取物正常大鼠血浆样品、灌胃苦荞提取物糖尿病大鼠血浆样品色谱图见图1。从图中可知，槲皮素与其他干扰组分分离效果良好，无杂质峰干扰。

2.2 线性范围及检测限 线性方程为Y =6973.5X +151.64 （r2=0.9995），血浆中槲皮素在0.171～6.840 mg/L之间线性关系良好，血浆中检测限为0.0570 mg/L。

2.3 准确度和精密度 该方法的准确度和精密度结果如表1所示。

2.4 提取回收率 低、中、高3个浓度血浆样品中槲皮素的提取回收率分别为83.1%、85.6%、84.8%，平均提取回收率为84.5%，符合药动学实验要求。

2.5 稳定性考察 结果表明，血浆样品预处理后室温放置24 h稳定；样品经4℃冰箱储存72 h保持稳定；样品在-20℃冰冻保存2周稳定。

图1 大鼠血浆样品中槲皮素的HPLC色谱图

表1 血浆样品中槲皮素的准确度和精密度 （n=5；±s）

表1 血浆样品中槲皮素的准确度和精密度 （n=5；±s）

浓度（mg/L） 日内精密度日间精密度测量值（mg/L） 准确度（%） 精密度（%） 测量值（mg/L） 准确度（%） 精密度（%）0.285 0.272±0.006 95.5 2.21 0.268±0.006 94.2 2.24 0.855 0.832±0.015 97.3 1.80 0.819±0.022 95.8 2.69 3.420 3.242±0.044 94.8 1.36 3.263±0.039 95.4 1.20

2.6 模型组大鼠的体重和血糖 与对照组大鼠体重（268.3±17.2）g、血糖（5.28±0.27） mmol/L比较，大鼠造模4周后体重（203.5±12.9） g、血糖数据（21.04±3.18）mmol/L明显变化，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠呈现明显的糖尿病症状：多饮、多食、多尿及体重急剧减少。血糖数据表明模型组大鼠为典型的糖尿病。

2.7 药动学结果 血药浓度数据见表2、3，用3P97药动学程序对血药浓度数据拟合计算，结果表明苦荞提取物中的槲皮素在正常大鼠和糖尿病大鼠体内的药动学均符合二房室模型，主要的药动学参数见表4，其平均药-时曲线见图2。

3 讨 论

表2 5只正常雄性SD大鼠体内槲皮素血药浓度数据（mg/L）

成功制备糖尿病大鼠模型是本实验的重要组成部分。目前，糖尿病大鼠造模以化学损伤法为主，即通过注射四氧嘧啶、链脲佐菌素、双硫腙等化学药物，制备糖尿病大鼠模型。也有一次性腹腔注射STZ55-60 mg/kg造模，还有高脂高糖饲料喂养联合腹腔注射低剂量STZ造模[6-9]，综合考虑大鼠造模的成活率以及与人体Ⅱ型糖尿病症状的接近，故本实验组选用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射制造糖尿病大鼠模型，剂量为35 mg/kg。

表3 5只雄性糖尿病SD大鼠体内槲皮素血药浓度数据（mg/L）

糖尿病患者机体代谢旺盛，典型症状表现为多饮、多食、多尿、身体消瘦，即“三多一少”。预实验时曾选用体重为180～220 g 大鼠进行造模，多数大鼠因过度消瘦或死亡，从而未完成实验，故本研究选择体重为 250 g左右的大鼠以保证实验顺利进行。

灌胃苦荞提取物后，槲皮素在糖尿病大鼠体内与正常大鼠体内相比发生了明显的变化，其中Cmax1、Cmax2、AUC0-12明显增加。这与文献[10,11]报道链脲佐菌素及高血糖环境能造成肝脏病变以及引起肝脏代谢酶的变化，所以推测可能为体内肝脏损伤及肝代谢酶变化导致槲皮素的代谢降低，从而导致糖尿病大鼠的Cmax和AUC0-12较正常大鼠有所升高。另外文献[12]中认为可能是糖尿病大鼠肠道微生态紊乱引起的产葡糖醛酸苷酶的细菌增加，从而导致黄酮苷转化为黄酮苷元。本研究的苦荞提取物中芦丁和槲皮素均为其主要成分[13]，由于肝脏病变及肝代谢酶的变化，导致体内黄酮成分芦丁的升高，继而芦丁在体内被葡糖醛酸苷酶代谢去苷转化为槲皮素，导致了槲皮素在糖尿病大鼠体内Cmax和AUC0-12的升高。本研究表明，同一药物在不同病理状态的体内表现为不同的体内过程，这正提示了以后的体内过程研究最好在与人体病症接近的动物模型体内进行更有实际参考意义。

同时，本研究中大鼠灌胃苦荞提取物后槲皮素在糖尿病大鼠体内有明显的双峰现象出现，表明槲皮素在糖尿病的大鼠肠道中存在重吸收或者同类成分之间的互相转化。通过上述推测分析，此现象可能为苦荞提取物中的另一主要黄酮成分芦丁在糖尿病大鼠体内被葡糖醛酸苷酶代谢去苷转化为槲皮素，从而导致二次吸收情况的发生，但具体的情况还需通过实验进一步证实。本实验研究对于苦荞提取物的新药及保健食品的开发，以及以后的临床使用剂量均有一定的指导意义。

图2 苦荞提取物中槲皮素在大鼠体内的药-时曲线

表3 苦荞提取物中槲皮素在大鼠体内的主要药动学参数 （n=5；>±s）

表3 苦荞提取物中槲皮素在大鼠体内的主要药动学参数 （n=5；>±s）

药动学参数 正常大鼠 糖尿病大鼠t1/2β（h） 32.874±11.251 53.381±12.562 AUC0-12（mg·h/L） 5.982±2.361 10.248±4.103 Tmax1（h） 0.25 0.25 Tmax2（h） - 4 Cmax1（mg/L） 1.022±0.280 1.477±0.356 Cmax2（mg/L） - 0.602±0.090

[1]孙博航，吴雅清，高慧媛，等. 苦荞麦的化学成分[J].沈阳药科大学学报，2008，25（7） :541.

[2]刘 巍，胡汉昆，刘薇芝，等. 苦荞提取物对2型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡的干预作用[J]. 中国药师，2014，17（1） :1-4.

[3]刘瑞敏. 苦荞降糖成分的提取与药效初步研究[D]. 成都：四川师范大学, 2012.

[4]朱红岗, 凌 明. 大鼠体内槲皮素的血药浓度测定及其药代动力学研究[J]. 中国药业, 2013, 22（2）: 14-15.

[5]Moon Y J, Wang L, DiCenzo R, et al. Quercetin phaemacokinetics in huamans [J]. Biopharm Drug Dispos, 2008, 29:205-217.

[6]Saeed D, Reza G, Rohollah N, et al. The effect of high-fat diet and streptozotocin-Induced diabetes and endurance training on plasma levels of calcitonin gene-Related peptide and lactate in rats [J]. Can J Diabetes, 2014, 38（6）: 461-465.

[7]Haniah S, Nepton S, Kianoosh M, et al. Modulation of GLUT4 expression by oral administration of Mg2+to control sugar levels in STZ-induced diabetic rats [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2014, 92（6）: 438-444.

[8]Saravanan G, Ponmurugan P, Deepa M A, et al. Modulatory effects of diosgenin on attenuating the key enzymes activities of carbohydrate metabolism and glycogen content in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Can J Diabetes, 2014, 38（6）: 409-414.

[9]Maha M. Antidepressant-like effect of simvastatin in diabetic rats [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2015, 93: 1-8.

[10]Baig N A，Herrine S K，Rubin R. Liver disease and diabetes mellitus [J]. Clin Lab Med，2001，21（1）:193-207.

[11]Shimojo N，Ishizaki T，Imaoka S，et al.Changes in amounts of cytochrome P450 isozymes and levels of catalytic activities in hepatic and renal microsomes of rats with streptozotocin-induced diabetes [J]. Biochem Pharmacol，1993，46（4） :621-627.

[12]邓远雄，杨昌华，牟玲丽. 黄连解毒汤中黄芩苷和汉黄芩苷在糖尿病大鼠体内的药动学[J]. 中草药，2008, 39（2）: 227-231.

[13]邹 亮，王战国，胡慧玲，等. 苦荞提取物中芦丁和槲皮素的含量测定[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（17）: 60-62.