不同精制工艺对复方生血口服液成分及初步药效的影响

吴晓燕 汪 晶 崔 丽 葛卫红

（1.南京鼓楼医院，江苏 南京 210008；2.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028）

复方生血口服液系在经典名方当归补血汤基础上形成的临床有效制剂[1]，由黄芪、当归、白术、党参、仙鹤草、鸡血藤、桑葚7味中药组成，具有补气养血、健脾补肾的功效。方中黄芪为君药，黄芪甲苷为其主要的质控指标，传统工艺采用醇沉法进行精制[2]，近年来发展了大孔吸附树脂、超滤、离心、絮凝澄清等新型精制方式[3]。本研究采用醇沉法、絮凝澄清法、超滤法对复方生血水提液进行精制，以药学及药效学指标对精制工艺进行评价，为选择复方生血口服液的精制工艺提供实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪；Alltech ELSD检测器；AB105电子分析天平（上海精密仪器有限公司）；天然絮凝澄清剂（山东科阳有限公司）；陶瓷膜超滤器（膜孔径50nm，膜面积0.1m2，久吾高科有限公司）；C18色谱柱（江苏汉邦科技有限公司）。

1.2 试剂 乙醇（工业用乙醇）；黄芪甲苷对照品（批号110781-200613，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈为色谱纯；纯净水（娃哈哈）；其他试剂均为分析纯；注射用环磷酰胺（江苏恒瑞医药，批号：130956）；全自动血细胞分析仪（贝克曼库尔特LH750）；地榆升白片（成都地奥集团，批号：130703）。

1.3 动物 ICR小鼠，雄性，体重18～22g，动物合格证号：SCXC（沪）2013-0016。

2 研究方法

2.1 采用不同精制工艺制备供试样品

2.1.1 水提液制备 按序称取复方生血处方中各饮片，加入10倍量水煎煮提取2次，每次2h，合并煎液，滤过，浓缩至每毫升含有1g生药，备用。参考文献[4-7]的方法采用醇沉、絮凝澄清、超滤方法制备供试样品。

2.1.2 醇沉法 取水提取液1份（相当于1kg生药量），减压浓缩至相对密度为 1.10～1.15（50℃），加入95%乙醇使含醇量达到60%，充分搅拌，静置24h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相同体积，备用。

2.1.3 陶瓷膜超滤 取水提取液1份，加水稀释至每毫升含有0.2g生药量，离心，上清液倒入储液罐，连接超滤器进行超滤，超滤至原体积85%时，加入原体积40%的水反复超滤，收集滤液，减压浓缩至相同体积，备用。超滤工艺参数：膜孔径200nm，膜面积0.1m2，温度 25～40℃，操作压力 0.15～0.2MPa，错流速度 0.2m/h。

2.1.4 絮凝澄清法 取天然澄清剂A，加少量蒸馏水搅成糊状，继续加水搅拌，制得1%黏胶液，双层纱布过滤，得组分A黏胶液；取天然澄清剂B，加水溶解，制得1%黏胶液，继续加入1%量醋酸搅拌，溶胀24h，双层纱布过滤，得组分B黏胶液。取水提取液1份，加水稀释至每毫升含有0.5g生药量，加入5%的组分B黏胶液，每隔30min搅拌一次；2h后，加入2.5%的组分A黏胶液，每隔60min搅拌一次，药液静置过夜，纱布粗过滤，滤纸过滤，减压浓缩至相同体积，备用。

2.2 黄芪甲苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈∶水（32∶68）为流动相，蒸发光散射检测器检测，漂移管温度105℃，载气流速2.7L/min，流动相流速1.0mL/min。色谱图见图1。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含有黄芪甲苷485μg的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取三种不同精制工艺浓缩液20mL，用水饱和正丁醇振摇4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[8]。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液5、8、10、15、20、30μL，注入液相色谱仪，以进样量的常用对数（X）为横坐标，峰面积的常用对数（Y）为纵坐标进行回归分析，得回归方程为：Y=1.7243X+11.424，r=0.9991（n=6）。结果表明，黄芪甲苷在2.425～14.55μg范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度考察 精密吸取对照品溶液，连续进样6次，测定黄芪甲苷峰面积，计算黄芪甲苷峰面积RSD为2.28%，结果表明精密度良好。

2.2.6 稳定性考察 取供试品溶液，室温放置，分别在制备后 2、4、8、12、24h 进样测定，计算黄芪甲苷的峰面积的RSD为3.13%，表明室温测定结果稳定。

2.2.7 测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。

2.3 药效评价

2.3.1 造模 参考文献[9]，采用化学损伤法，制备小鼠外周白细胞减少模型。小鼠以环磷酰胺100mg/kg腹腔注射，每日1次，连续4d。4d后外周白细胞（WBC）数下降至4×109/L即为造模成功。

2.3.2 分组与给药 取造模成功的小鼠，按白细胞（WBC）随机分为6组，每组10只，分别为：模型组，灌胃生理盐水20mL/kg；阳性药物组，灌胃地榆升白片（10×临床日用量/60kg）；水提液组，灌胃生血复方水提液（10×临床日用量/60kg）；醇沉组，灌胃醇沉供试品溶液（10×临床日用量/60kg）；超滤组，灌胃超滤供试品溶液（10×临床日用量/60kg）；絮凝澄清组：灌胃絮凝澄清供试品溶液（10×临床日用量/60kg）。另取10只正常小鼠为空白对照组，灌胃生理盐水20mL/kg。各组按上述剂量每日以20mL/kg的容积灌胃给药1次，连续4d。

2.3.3 指标检测 末次灌胃给药1h后，眼眶取血，肝素抗凝，于血细胞分析仪上进行白细胞、红细胞、血小板含量测定。

2.3.4 统计学方法 所有数据采用SPSS17.0统计软件处理，计量资料均数用（）表示，采用 t检验或秩和检验分析，P＜0.05表示有显著性差异。

3 研究结果

3.1 不同工艺精制后生血复方中黄芪甲苷含量比较 见表1。

表1 不同工艺精制后生血复方中黄芪甲苷含量比较

3.2 不同工艺精制后生血复方药效学评价 见表2。

表2 各组小鼠治疗后外周血象比较（）

表2 各组小鼠治疗后外周血象比较（）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

4 讨论

药学实验结果表明，醇沉法对黄芪甲苷保留率较高，絮凝澄清其次，超滤较低，可能由于超滤过程中增加了稀释超滤-浓缩的过程，导致指标性成分有所降低。药效实验结果表明，醇沉法、超滤法制备的样品干预白细胞减少模型小鼠后与模型组相比，外周血白细胞、红细胞计数均显著提高（P＜0.05），升高白细胞效果明显，而絮凝澄清则药效较差；动物死亡数各组间无显著性区别。超滤法对黄芪甲苷保留率相对较低，但药效结果却好于絮凝澄清，推测由于中药复方成分复杂，指标性成分可能无法完整体现复方的药效。综合分析，醇沉法和超滤法更适合于复方生血口服液的精制。

本研究以黄芪甲苷作为药学指标，血虚模型小鼠白细胞作为药效学指标，考察了不同精制方式对复方生血水提取液的影响，结果发现单独以指标性化学成分来进行评定时，可能不能完整体现不同工艺的区别。在进行中药复方精制过程中，通过结合药学及药效学两种指标，对复方进行个体化筛选，可更好地体现精制工艺的科学性和合理性。此外，不同的精制方式含有不同的精制原理，对复方中主要活性成分群的影响也不同，其适宜性也不尽相同，本研究仅选取了单一药学及药效学指标，不够全面，后续将展开进一步研究。

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