鸟苷酸的发酵研究

韩永青 （常州市天成安全评价有限公司，江苏 常州 213164）

1 乌苷酸简介

5′-鸟嘌呤核苷酸，又名乌苷酸（Guanosine-5′-monophos⁃phate,代号GMP）。乌苷酸是组成核酸的五种核苷酸之一。核苷酸是生命组成形式的精华，在生物的遗传变异、生长发育和蛋白质的合成中起着重要作用。核苷酸在医疗上也有很大的作用。可以治疗急性和慢性肝炎、中毒性肝炎、肝硬化、血小板减少症、冠状和动脉功能梗塞、风湿性心脏病等。可用于治疗放射病，改善骨髓造血系统，使白血球回升，还能治疗中心性视网膜炎、视神经萎缩症等病。

经典的乌苷酸提取方法是随着分子生物技术的发展而发展起来的。从质粒中提取鸟苷酸采用SDS碱裂解法：将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS包盖，当用钾离子取代纳离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可从上清中回收复性的质粒DNA。从真核细胞中提取乌苷酸可采用蛋白酶K和苯酚处理细胞裂解液。用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性，再用蛋白酶K消化细胞或组织，乌苷酸通过有机溶剂苯酚抽提进行纯化[1]。

2 乌苷酸生产工艺

乌苷酸有两类生产方法。一类是酶法，它又可分为两种:①用青霉菌5`-磷酸二酯酶水解酵母核糖核酸(RNA)，②在一定条件下由细菌内部的酶降解RNA，并使细菌自溶，从而得到核苷酸。另一类是发酵法，它也可分两种方法:①先发酵生产核苷,然后再磷酸化制取乌苷酸。

②利用细菌发酵一步生产核苷酸。在两类方法中,目前以发酵法为主。

2.1 生产原理[2]

酶解法生产5’-核苷酸起始于日本，50-60年代研制成功。其技术关键是筛选到产生5’-磷酸二酯酶的菌株。5’-磷酸二酯酶可催化RNA成寡核苷酸分子的核糖上碳原子羟基与磷酸之间形成的二酯键断裂，随之生成4种5’-单核苷酸。1957年，日本科学家从桔青酶中分离出5’-磷酸二酯酶，从而发展形成酶解法生产5’-鸟苷酸。

2.2 磷酸二酯酶的制备[3]

将核酸降解为5’-单核苷酸，关键的一步是找到大量产生5’-磷酸二酯酶的菌株。5’-磷酸二酯酶可由桔青酶或金色链霉菌产生。

桔青酶在察氏斜面培养基培养3-4天，即可制作麸皮去，30℃培养5天左右曲子成熟。制作的曲子用水浸泡，保温适当时间后进行抽提，提取液即为初酶液。

5’-磷酸二酯酶也可采用液体深层发酵法获得，使用菌种也为桔青酶，其工艺流程：斜面菌种培养-种子培养-发酵培养-滤液。

此种发酵液的酶活可达600U/ML。利用金色链霉菌生产5’-磷酸二酯酶一般采用液体深层发酵法。金色链霉菌不仅含有5’-磷酸二酯酶，同时还含有脱氨酶，脱氨酶可使4种单核苷酸中的5’-腺苷酸、经脱氨后生成5’-肌苷酸，因此，在使用该菌生产助鲜剂时，由于含有两种酶，则可以同时得到肌苷酸和鸟苷酸。

2.3 乌苷酸提取

鲜酵母制备：以糖蜜或亚硫酸纸浆废液培养面包酵母，经离心后得湿菌体即为鲜酵母。

抽提：目前采用的可分为浓盐法和碱解法两种方法进行提取。

①浓盐法：将鲜酵母加适量水后，加NaCL至其浓度为10%左右，保温，搅拌，离心取上清液。调pH后离心收集沉淀物，洗涤除杂即可得到乌苷酸泥。

②碱解法：将新鲜酵母压榨成酵母泥，加NaOH水溶液，在一定温度下低速搅拌。离心去掉菌体碎渣。上清液调，离子交换树脂对不同的5’-单核苷酸pH，搅拌时加MgCl2，离心后取沉淀物溶于水中。

2.4 乌苷酸酶解

将一定浓度的乌苷酸溶液加温，并加入5’-磷酸二酯酶。经酶解一定时间后升温。离心后可得5’-单核苷酸的混合液。

2.5 5’-鸟苷酸的分离

鸟苷酸的分离一般采用离子交换树脂法。该方法的原理是在一定条件下，离子交换树脂对不同的5’-单核苷酸有不同的吸附力。随着pH值的变化，不同单核苷酸上的氨基解离的程度不同，这样可按不同顺序依次洗脱下来。其具体作法：树脂处理-阳离子树脂柱分离-去除5’GMP-去阴离子树脂柱-洗脱5’GMP.

3 结语

目前，国内外大力开展固定化5’-磷酸二酯酶和脱氨酶的固定化技术。国外由于采用固定化酶技术，使成本降低，乌苷酸降解率稳定，有利于单核苷酸的分离和精制。缺点和酶活力回收率不高，载体成本高，应用5’-磷酸二酯酶降解酵母乌苷酸，核苷酸转化率可达70%以上。

[1]冯琦.核酸药物的研究现状与展望[J].中国生化药物杂志，2006(3):156-159.

[2]蔡显鹏等.乌苷发酵过程分析[J].食品与发酵工业，2002,28（9）：5-9.

[3]杨静，吴大成，金辉等.反义核酸药物的研究和应用[J].医学学报2008(7).