虎尾草黄酮类化学成分研究

2015-03-27郭利群张丽玲

生物质化学工程 2015年4期

关键词：异鼠鼠李糖层析

郭利群，张丽玲

(1.云南医药工业股份有限公司,云南昆明 650106； 2.云南植物药业有限公司,云南昆明 650109)

·研究报告——生物质活性成分·

虎尾草黄酮类化学成分研究

郭利群1，张丽玲2

(1.云南医药工业股份有限公司,云南昆明 650106； 2.云南植物药业有限公司,云南昆明 650109)

对虎尾草药材地上部分用70%乙醇提取后，以大孔吸附树脂、聚酰胺和硅胶等分离材料进行分离和纯化，从中分得10个黄酮类化合物，利用氢谱、碳谱、质谱和颜色反应等手段对其结构进行确认，10个化合物依次为槲皮素(Ⅰ)、山奈酚(Ⅱ)、异鼠李素(Ⅲ)、槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷(异槲皮苷)(Ⅳ)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(槲皮苷)(Ⅴ)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷(Ⅶ)、金丝桃苷(Ⅷ)、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷(Ⅸ)和芦丁(Ⅹ)，其中化合物Ⅴ、Ⅵ为首次从该植物中分离得到,化合物Ⅲ、Ⅸ为首次从该属植物中分离得到。

虎尾草；化学成分

虎尾草(LysimachiabarystachysBunge)，别名狼尾花、伸筋草(白族)，为报春花科虎尾草，多年生草本，主要生长在云南文山、洱源、丽江和香格里拉等地，海拔为2 100～2 700米的山坡、路旁、较潮湿处。具有活血散瘀、清热消肿、调经、利尿等功效[1]，已作为药材收载于2005年版《云南省中药材标准》第一册。化学成分研究结果表明，该植物主要含有黄酮类等化合物[2-5]。为了开发利用民族药的资源，作者对云南香格里拉产虎尾草地上部分进行了化学成分研究，从其乙醇提取物中分得10个黄酮类化合物，并进行了结构鉴定。

1 实验

1.1 材料和仪器

所用样品于 2012年8月采自云南省香格里拉维西县，海拔2 650米,原植物经云南省药物研究所资源分类室高丽正高级工程师鉴定为虎尾草(LysimachiabarystachysBunge)。对照品为：槲皮素、山奈酚、鼠李糖、槲皮苷、金丝桃苷和芦丁(中国食品药品检定研究院提供)。大孔吸附树脂，西安蓝深特种树脂有限公司生产的LS-300B；薄层层析硅胶和柱层析硅胶，青岛海洋化工厂；高效薄层板，Merck公司；聚酰胺粉(75～150 μm)，国药集团化学试剂有限公司；羟丙基葡聚糖凝胶LH-20，GE Healthcare,瑞士，所用试剂均为分析纯。X-4型显微熔点测定仪,北京泰克仪器有限公司;Finnigan Mat 95质谱仪，德国Finnigan Mat公司；Q-TOF Micro LC-MS质谱仪，安捷伦科技;Bruker DRX-400 MHz核磁共振仪，德国 Bruker；核磁共振氢谱和碳谱由中科院昆明植物研究所测定(TMS为内标，CDCl3、DMSO-d6为溶剂)。

1.2 提取与分离

取虎尾草药材地上部分5 kg，去除泥土后进行粗粉碎，用70%乙醇热回流提取2次，按液料比10 ∶1(mL ∶g)加入溶剂 50 000 mL，回流2 h，合并两次提取液，提取液回收乙醇后上聚酰胺柱，依次用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇梯度洗脱，流速为15 mL/min。

薄层层析表明，70%乙醇提取物主要为黄酮类化学成分，分别将聚酰胺柱层析得到的不同乙醇浓度洗脱液与70%乙醇提取物进行薄层层析比较，黄酮类化学成分主要存在于30%、50%和70%乙醇洗脱物中。

2 结果与讨论

2.1 化合物鉴定

化合物Ⅰ：黄色粉末状结晶(甲醇)，m.p.309～310 ℃，HCl-Mg反应呈阳性，Molish反应阴性。 UVλmax257和372 nm，LC-ESIMS显示相对分子质量为302。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.72(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.62(1H,dd,J=2.2,10.7 Hz,H-6′),6.87(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.17(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),12.47(1H,s,5-OH),12.45(1H,s,5-OH),10.76(1H,s,7-OH),9.56,9.35,9.27(each 1H,s,3,3′,4′-OH),上述数据与文献[3]基本一致。薄层层析与槲皮素对照品在3个展开系统中Rf值一致并呈一个相同颜色的斑点，故鉴定为槲皮素(quercetin)。

化合物Ⅱ：黄色粉末状结晶(甲醇)，m.p.277～279 ℃，HCl-Mg反应呈阳性,Molish反应阴性。LC-ESIMS显示相对分子质量为286,UVλmax265和367 nm。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：8.06(2H,d,J=9.3 Hz,H-2′,H-6′),6.88(2H,J=9.3 Hz,H-3′,H-5′),6.37(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.15(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),12.08(1H,s,5-OH)，9.72(1H,s,7-OH)，9.45,9.02(each 1H,s,3,4′-OH)，上述波谱数据与文献[1-3,6-7]基本一致。薄层层析与山奈酚对照品在2个展开系统中Rf值一致并呈一个相同颜色的斑点，故鉴定为山奈酚(kaempferol)。

化合物Ⅲ：黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性，Molish反应阴性。LC-ESIMS显示相对分子质量为316。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:6.72(1H，d，J=1.9 Hz，H-6)，6.87 (1H，d，J=1.9 Hz，H-8)，8.35(1H，d，J=1.9 Hz，H-2′)，7.41(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，8.22(1H，d，J=8.4，1.9 Hz，H-6′)，3.87 (OMe)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:148.3(C-2)，137.5(C-3)，177.1(C-4)，157.5(C-5)，99.6(C-6)，164.6(C-7)，94.1(C-8)，162.6 (C-9)，104.3 (C-10)，123.2 (C-1′)，116.3(C-2′)，147.7 (C-3′)，149.1 (C-4′)，112.1(C-5′)，123.1(C-6′)，56.5(OMe)，以上数据与文献[7]报道的异鼠李素数据基本一致，故化合物Ⅲ鉴定为异鼠李素(isorhamnetin)。

化合物 Ⅳ：浅黄色针状结晶(甲醇)，m.p.231～232 ℃，HCL-Mg反应呈红色，Molish反应阳性。LC-ESIMS显示相对分子质量为464，UVλmax257和359 nm。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：7.70(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.58(1H,dd,J=10.8,2.3 Hz,H-6′),6.86(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.39(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),5.36(1H,d,J=7.4 Hz,葡萄糖H-1，β构型),上述波谱数据与文献[8]基本一致。化合物Ⅳ用5%硫酸液水解得黄色针晶，熔点308～309 ℃，纸层析和薄层层析与槲皮素对照品Rf值一致，糖溶液薄层层析与葡萄糖Rf值一致，化合物Ⅲ紫外带Ⅰ与苷元槲皮素比较，紫移10 nm，锆—柠檬酸反应阴性，指示糖连接在3位羟基上。综上结果证明化合物Ⅳ为槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷(异槲皮苷，isoquercetin)。

化合物Ⅴ：淡黄色针状结晶(甲醇)，m.p.181～182 ℃，HCl-Mg反应呈红色，Molish反应阳性。LC-ESIMS显示相对分子质量为447，UVλmax257和359 nm。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：12.46(1H,s,5-OH),10.76(1H,s,7-OH),9.56(1H,s,4′-OH),9.26(1H,s,3′-OH),7.21(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′)，7.18，(1H,dd,J=10.5,2.1Hz,H-6′),6.78(1H,d,J=8.1Hz,H-5′),6.23(1H,d,J=1.8 Hz,H-8),6.06(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),2.50～5.25(m，8H,糖上质子和糖上羟基质子),上述波谱数据与文献[8-9]基本一致。化合物Ⅴ用5%硫酸液水解得黄色针晶，熔点308～310 ℃，纸层析和薄层层析与槲皮素对照品Rf值一致，糖溶液薄层层析显示一个糖的色斑，与鼠李糖的Rf值一致,取化合物Ⅴ与槲皮苷标准品进行薄层层析对照，二者的Rf值一致，二者相混后熔点不下降。根据以上实验结果和数据，化合物Ⅴ确定为槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷，即槲皮苷(quercitrin)。

化合物Ⅵ：淡黄色针状结晶(甲醇)，m.p.169～171 ℃，HCl-Mg反应呈红色，Molish反应阳性。LC-ESIMS显示相对分子质量为448，UVλmax266和351 nm。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：12.44(1H,d,J=2.0 Hz,5-OH),8.12(2H,dd,J=9.1，2.1 Hz,H-2′，H-6′),6.98(2H,J=9.3 Hz,H-3′,H-5′),6.43(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.22(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),5.17(1H,d,J=7.8 Hz,葡萄糖H-1)，3.07～3.80(m,糖上质子和糖上羟基质子)。13C NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:156.3(C-2)，132.8(C-3)，176.8(C-4)，161.7(C-5)，98.7(C-6),165.1(C-7),93.3(C-8),156.4(C-9),103.1(C-10),121.9 (C-1′),130.1(C-2′，C-6′),115.8(C-3′，C-5′)，159.3(C-4′),101.5(C-1″)，73.6 (C-2″)，75.5 (C-3″)，69.1 (C-4″),77.2(C-5″)，61.8(C-6″)，其波谱数据与文献[7-9]基本一致。根据以上试验结果和波谱数据，化合物Ⅵ确定为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol-3-O-β-D-glucoside)。

化合物Ⅶ：淡黄色针状结晶(甲醇)，m.p.169～171 ℃，HCl-Mg反应呈红色，Molish反应阳性。LC-ESIMS显示相对分子质量为448，UVλmax266和351 nm。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：12.44(1H,d,J=2.0 Hz,5-OH),8.06(2H,d,J=9.1 Hz,H-2′,H-6′),6.88(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′,H-5′),6.41(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.22(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),5.27(1H,d,J=7.8 Hz,H-1″)，3.07～3.80(m,糖上质子和糖上羟基质子)。13C NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:157.3(C-2)，133.8(C-3)，178.8(C-4)，161.7(C-5)，98.7(C-6),165.1(C-7),93.3(C-8),156.4(C-9),103.8(C-10),121.9 (C-1′),130.9(C-2′，C-6′),114.8(C-3′，C-5′)，159.9(C-4′),103.5(C-1″)，71.6 (C-2″)，73.5 (C-3″)，69.1 (C-4″),76.2(C-5″)，60.8(C-6″)，其波谱数据与文献[7]基本一致。根据以上实验结果和波谱数据，化合物Ⅶ确定为山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷(kaempferol-3-O-β-D-galactoside)。

化合物Ⅷ：淡黄色针状结晶，m.p.225～227 ℃ ，HCl-Mg反应呈红色，Molish反应阳性。LC-ESIMS显示相对分子质量为464，UVλmax257和359 nm。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.62 (1H，s，5-OH),10.88(1H，s，7-OH),9.75(1H，s，3′-OH),9.22 (1H，s，4′-OH),7.67(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′),7.52(1H，s，H-2′),6.80 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.37 (1H，s，H-8)，6.17 (1H，s，H-6),5.37 (1H，d，J=8.2 Hz，葡萄糖端基H，β构型),3.01～3.64(6H，m，葡萄糖质子)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ:156.4 (C-2)，133.5 (C-3)，177.6(C-4)，161.4(C-5)，98.9 (C-6)，164.8(C-7)，93.8 (C-8)，156.6 (C-9)，103.9 (C-10)，121.3 (C-1′)，115.1 (C-2′)，144.9 (C-3′)，148.4 (C-4′)，115.8 (C-5′)，122.1 (C-6′),102.1 (C-1″)，75.9 (C-2″)，73.6 (C-3″),71.5 (C-4″)，67.9 (C-5″)，60.6(C-6″),上述波谱数据与文献[8-10]基本一致，取化合物Ⅷ与金丝桃苷标准品进行薄层层析对照，二者的Rf值一致，二者相混后熔点不下降。该化合物鉴定为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(金丝桃苷，hyperoside)。

化合物Ⅸ：淡黄色针状结晶(甲醇)，m.p.169～170 ℃，HCl-Mg反应呈红色，Molish反应阳性。LC-ESIMS显示相对分子质量为624，UVλmax253、 266和358 nm。化合物Ⅸ用5%硫酸液水解后显示两个糖的色斑，其Rf值分别与葡萄糖和鼠李糖对应，取水解后的苷元与异鼠李素做薄层层析对照，二者显示相同的Rf值，二者相混熔点不下降。锆-柠檬酸反应显阴性，指示糖连接在3位羟基上。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:8.03(d,J=2.1Hz,H-2′),7.59(dd,J=1.8,10.2 Hz,H-6′),6.90(d,J=2.9 Hz,11.4 Hz,H-5′),6.40(d,J=2.1 Hz,H-8),6.20(d,J=2.1Hz,H-6),5.24(d,J=7.5 Hz,H-1″),4.52(d,J=1.5 Hz,H-1),3.96(3′-OMe),3.20～4.00(m,糖质子),1.15(4H,d,J=2.7 Hz,H-6)。13C NMR(125 MHz ，DMSO-d6)δ:156.51(C-2)，133.0(C-3)，176.72(C-4)，160.79(C-5)，99.24(C-6)，164.0(C-7)，93.95(C-8)，156.20(C-9)，103.4(C-10)，121.02(C-1′)，115.06(C-2′),149.35(C-3′),146.90(C-4′)，113.44(C-5′)，121.83(C-6′)，55.84(OCH3)，101.4(C-1，葡萄糖)，74.3(C-2，葡萄糖)，76.7(C-3，葡萄糖)，70.8(C-4，葡萄糖)，76.0(C-5，葡萄糖)，66.9(C-6，葡萄糖)，100.7(C-1，鼠李糖)，70.3(C-2，鼠李糖)，70.4(C-3，鼠李糖)，72.1(C-4，鼠李糖)，68.1(C-5，鼠李糖)，17.5(C-6，鼠李糖)，上述波谱数据与文献[9-11]基本一致。综上所述，化合物Ⅸ鉴定为异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷(isorhamnetin-3-O-β-D-rutinoside)。

化合物Ⅹ：黄色粉末，m.p.179～181 ℃ ，易溶于甲醇，HCl-Mg反应呈红色，三氯化铝反应呈黄色荧光,Molish反应阳性。LC-ESIMS显示相对分子质量为610，UVλmax257和361 nm。盐酸镁粉反应呈阳性。薄层色谱分析在3种不同的展开系统中与芦丁对照品Rf值一致，与对照品混合熔点不下降,化合物Ⅹ鉴定为芦丁 (rutin)。

2.2 化合物结构

1.2节分离得到的化合物Ⅰ～Ⅹ分别通过颜色反应、与对照品进行LC对照分析、LC-ESIMS、1H NMR、13C NMR等分析方法进行了结构鉴定。

结构式为：

3 结论

从虎尾草(地上部分)的乙醇提取物中分离得到了10个黄酮类化合物，其结构鉴定结果依次为槲皮素(Ⅰ)、山奈酚(Ⅱ)、异鼠李素(Ⅲ)、槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷(异槲皮苷)(Ⅳ)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(槲皮苷)(Ⅴ)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷(Ⅶ)、金丝桃苷(Ⅷ)、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷(Ⅸ)和芦丁(Ⅹ)，其中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷为首次从该植物中分离得到，化合物异鼠李素、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷为首次从该属植物中分离得到的化合物。

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Chemical Constituents of Flavonoids fromLysimachiaBarystachysBunge

GUO Li-qun1, ZHANG Li-ling2

(1.Yunnan Pharmaceutical Industrial Co.,Ltd., Kunming 650106, China； 2.Yunnan Phytopharmaceutical Co.,Ltd., Kunming 650109, China)

Ten compounds were extracted by 70%ethanol and then isolated with silica gel and polyamide chromatography from the aerial parts ofLysimachiabarystachysBunge.Their structures were determined by spectral analysis and chemical evidence.They were identified as quercetin(Ⅰ),kaempferol(Ⅱ),isorhamnetin(Ⅲ),quercetin-3-O-β-D-glucoside(Ⅳ),quercitrin(Ⅴ),kaempferol-3-O-β-D-glucoside (Ⅵ)，kaempferol-3-O-β-D-galactoside(Ⅶ)，hyperoside(Ⅷ)，isorhamnetin-3-O-β-D-rutinoside(Ⅸ)and rutin (Ⅹ).Compounds Ⅴ，Ⅵ were isolated from this plant and compoundsⅢ,Ⅸ were isolated from this genus for the first time.

LysimachiabarystachysBunge；chemical composition