基于微通道的ZnO 纳米棒生物荧光检测研究*

刘向飞，蒋 栋，赵振杰，李 欣

(1.华东师范大学 纳光电集成与先进装备教育部工程研究中心，上海200062;2.华东理工大学 分析测试中心，上海200237)

0 引 言

氧化锌(ZnO)纳米材料作为一种II－VI 族半导体纳米材料，具有较好的光学和电学响应，被广泛用于太阳能电池、紫外传感器、场发射器件等［1］。同时，ZnO 纳米材料还具有比表面积高、电子迁移率高、电化学活性和化学稳定性等特点，可结合场效应管［2］、压电效应［3］、电化学检测［4］、光学检测［5］等技术研制不同类型高灵敏度的生物传感器。近年来，多项研究工作表明:ZnO 纳米材料在生物医学检测的应用上得到了快速发展［6］，具有广阔的应用前景。其中，一维ZnO 纳米材料能提高荧光检测性能［7，8］，用于研制新型的生物荧光检测器，深化了荧光检测在生物学、疾病诊断等领域的应用［9，10］。然而，不断发展的高通量检测对ZnO 纳米材料的制备工艺、器件集成提出了新的要求。

目前，ZnO 纳米材料的制备主要包括水热法［11］、化学气相沉积法［12］、电化学沉积法［13］等。其中，水热法具有成本低廉、工艺简单、可操作性强等特点［14］，便于工艺的集成与器件的研制。然而常规水热法合成中，反应物会不断消耗，只能通过更换生长液来获得较长的纳米棒。目前，在微流控芯片中合成ZnO 纳米棒，生长溶液可不断更新，有利于保持反应物浓度的稳定，从而获得较长的ZnO 纳米棒，并用于检测pH 值、研制气体传感器等［15，16］。同时，微流控芯片具有微型化、消耗少、便于集成等特点，与传统荧光检测器件相比，集成了纳米材料的高灵敏度芯片传感器具有突出的优势，是生物检测技术发展的重要方向［17］。

本文提出在具有阵列式微通道的微流控芯片中，利用种子法和水热合成技术制备ZnO纳米棒，通过对样品的表征和测试，比较并分析了采用常规条件和微通道芯片制备的ZnO 纳米棒的结构和形貌特征。同时，本文建立了基于阵列式微通道的ZnO 纳米棒生物荧光检测方法，以异硫氰酸荧光素标记的羊抗牛IgG 抗体为例对ZnO 纳米棒的荧光检测性能进行了研究。

1 实 验

1.1 试 剂

其中，六水硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)、六亚甲基四胺(HMTA)、二水乙酸锌(C4H6O4Zn·2H2O)、氨水(NH3·H2O)购自国药集团化学试剂有限公司，聚乙烯醇(PVA)、聚醚酰亚胺(PEI)购自美国Sigma－Aldrich 公司，异硫氰酸荧光素标记的羊抗牛IgG 抗体(FITC－antiIgG)购于美国ImmunoReagents公司。

1.2 种子层的制备

采用溶胶—凝胶法和旋涂法制备ZnO 种子层。方法如下:首先，称取0.25 g PVA 溶解于5 mL 去离子水中，70 ℃下搅拌1 h 形成透明液体;冷却后加入0.05 g 的乙酸锌，室温下搅拌2 h 得到种子溶液。然后，将种子溶液旋涂在载玻片上，转速为3 000 rpm，时间为1 min。最后，将得到的薄膜在500 ℃下热处理3 h，得到ZnO 的种子层。

1.3 ZnO 纳米棒的制备

本文采用水热法分别用在常规条件下和微通道中制备ZnO 纳米棒。

ZnO 生长溶液的制备:分别将0.744 g Zn(NO3)2·6H2O，0.175 g HMTA，0.4 g PEI 溶解于100 mL 去离子水中，再缓慢加入1.5 mL NH3·H2O 搅拌均匀并调节pH 值至10.6。

常规条件下水热法制备ZnO 纳米棒:将种子层基底正面向下放入生长溶液中，距离容器底部约1 cm 处，在90 ℃温度下生长3 h。最后取出样品用去离子水冲洗并用氮气吹干。

微通道中水热法制备ZnO 纳米棒:具有阵列微通道结构的微流控芯片是用软光刻工艺制备的。芯片模板购自武汉介观生物科技有限责任公司，通道长度为1.5 cm，宽度为500 μm，高度为50 μm。制备ZnO 纳米棒时，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道用氧等离子体处理后置于ZnO 种子层上方并密封(图1)。其后，用注射泵(流速为10 μL/min)将生长溶液通入微通道中，在90 ℃温度下生长3 h。最后，用去离子水冲洗通道并用氮气吹干，得到ZnO 纳米棒阵列。

1.4 样品的表征

采用原子力显微镜(AFM，Nano Wizard II)分析ZnO 种子层表面形貌，使用扫描电子显微镜(SEM，Hitachi S—4800)和X 射线衍射仪(XRD，Rigaku，Ultima IV)分别对ZnO 纳米棒的表面形貌和晶体结构的特性进行表征。

图1 微流控芯片中制备ZnO 纳米棒阵列的示意图Fig 1 Diagram of ZnO nanorods arrays fabricated by microfluidic chip

1.5 FITC－antiIgG 的检测

将FITC－antiIgG 溶于pH 值为7.4 的磷酸盐缓冲液(PBS)中，配置不同浓度的FITC－antiIgG 溶液(1×10－6～100 μg/mL)，以5 μL/min 的流速通入微通道中，10 min 后用PBS 和去离子水清洗并用氮气吹干。所有样品采用荧光显微镜(重庆奥特BDS200—FL)观察，对所得图像用imageJ 进行处理，分析荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 ZnO 纳米棒的表征分析

为研究微通道中制备的ZnO 纳米棒形貌特征，分析与常规条件下制备样品的差异，本文利用SEM 对两种条件制备的ZnO 纳米棒形貌进行了表征，如图2 所示。分析SEM照片可得，常规条件下制备的ZnO 纳米棒的平均直径、长度分别为0.05，1.26 μm，取向稍显杂乱。微通道中制备的ZnO 纳米棒的平均直径、长度分别为0.1，10 μm，且垂直于基底生长。微通道中制备的纳米棒的长度和直径均有显著增加，且密度较小。造成尺寸差异的主要原因是在常规条件下制备ZnO 纳米棒时，基底表面反应物的更新主要依靠扩散来完成。然而在微通道中制备ZnO 纳米棒时，反应物的更新主要依靠生长液的灌流，使生长表面保持较稳定的浓度。所以，ZnO 纳米棒的直径和长度均有显著增加。同时，邻近的纳米棒出现了融合生长的现象，导致其密度降低，并于底部逐渐融合成薄膜。

图2 不同合成条件下ZnO 纳米棒的SEM 图Fig 2 SEM images of ZnO nanorods synthesized in various conditions

为了分析制备的ZnO 纳米棒的晶体结构，本文对两种合成条件下的ZnO 纳米棒进行了X 射线衍射分析，如图3所示，两种ZnO 纳米棒具有相似的XRD 图谱。通过对比标准谱图(JCPDS NO.36—1451)，两种合成条件下的ZnO 纳米棒均为六方纤锌矿结构，(002)方向的衍射峰最强，说明其良好的c 轴取向性和结晶度。微通道中制备的ZnO 纳米棒的(002)衍射峰强度约为常规方法的4 倍，表明微通道在制备c 轴取向性好的ZnO 纳米棒方面更有优势。

图3 不同合成条件下ZnO 纳米棒的XRD 图Fig 3 XRD patterns of ZnO nanorods synthesized in different conditions

2.2 ZnO 纳米棒荧光检测性能分析

本文以10 μg/mL 的FITC－antiIgG 为模型分子研究了ZnO 纳米棒的荧光检测性能。首先，分别以玻璃、ZnO 种子层、微通道中制备的ZnO 纳米棒为载体，在微通道中对蛋白的荧光强度进行了检测，如图4(a)所示。可见，玻璃和ZnO种子层载体上观察不到荧光信号，而微通道中制备的ZnO纳米棒载体的荧光信号清晰可见。从荧光强度的分布(图4(b))也可以发现，玻璃和ZnO 种子层上的荧光强度与背景信号相似，而微通道中制备的ZnO 纳米棒荧光信号显著增强，是蛋白样品的良好载体。

图4 不同载体上FITC-antiIgG 的荧光照片与荧光强度分布Fig 4 Fluorescent photos and fluorescence intensity profile of FITC-antiIgG on different carriers

本文还利用阵列式微通道制备的ZnO 纳米棒在各通道中检测不同浓度FITC－antiIgG 的荧光强度，如图5 所示。通道1～11 的检测浓度分别为0，1×10－6，1×10－5，1×10－4，1×10－3，0.01，0.1，1，10，50，100 μg/mL。从图5(a)，(b)中可以看出:随着蛋白浓度从0 增加到100 μg/mL，荧光强度也随之增强。通过分析荧光强度(图5(c))可以发现，利用ZnO 纳米棒检测蛋白，在低浓度范围内有很好的响应。当蛋白浓度为1×10－6，1×10－5μg/m 时，荧光信号强度接近于背景信号。浓度在1×10－4～10 μg/mL 范围内，如图5(c)中插图所示，荧光强度与蛋白浓度的对数值基本呈线性变化，检测限为10－4μg/mL。浓度继续增大到50 μg/mL 后，荧光强度达到最大值。实验结果表明:微通道中制备的ZnO 纳米棒可用于生物蛋白的检测，具有较高的检测灵敏度。此外，运用阵列式微通道的芯片，可同时检测多种样品，减少样品消耗，降低检测成本。

图5 ZnO 纳米棒上FITC-antiIgG 的荧光照片、荧光强度分布及荧光强度随浓度的变化Fig 5 Fluorescent photos intensity profiles of FITC-antiIgG on ZnO nanorods platform change of fluorescence intensity with concentration

ZnO 纳米棒载体荧光增强效应的机制主要包括两个方面。首先，ZnO 纳米棒具有高等电点，在中性缓冲液中，ZnO 纳米棒表面富集正电荷，是检测生物分子的优良载体［6］;其次，ZnO 纳米棒作为波导传输光信号时，光场沿轴向传播，在纳米棒外部形成消逝场，使穿透深度范围内的荧光分子得到更强的激发［18］。和常规方法相比，微通道中制备的ZnO 纳米棒的直径和长度较大，比表面积高，有利于蛋白吸附。同时，微通道中制备的ZnO 纳米棒结晶性和取向性更好，有利于光传输和荧光信号检测，对检测低浓度样品具有重要作用。

3 结 论

本文利用水热法，在阵列式微通道中制备了ZnO 纳米棒，建立了一种基于微通道的生物荧光检测方法，并研究了ZnO 纳米棒的荧光检测性能，对FITC－antiIgG 的检测限可达1×10－4μg/mL。结果表明:和常规条件下制备的ZnO 纳米棒相比，微通道中制备的ZnO 纳米棒的比表面积、结晶性和c 轴取向性均有较大提高，可显著增强荧光信号。利用阵列式微通道芯片可同时检测多种样品，提高检测效率，为研制高通量、高灵敏度生物荧光检测传感器提供了一种新方法和研究依据。

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