菊科植物青蒿细胞色素P450基因家族分析

郭书巧， 束红梅， 巩元勇， 蒋 璐， 朱静雯， 倪万潮

(江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏 南京 210095)

细胞色素P450(P450)广泛存在于各种形式的生命体中，它是自然界中最大且最古老的家族［1-2］。在植物中，P450主要参与植物体内初级和次级代谢反应，并发挥重要的催化作用。其催化反应的底物包括内源性物质，如脂类、黄酮类、萜类、生物碱类等以及外源性物质，如农药、除草剂等［3］。P450底物与功能的多样性是为了适应各种组织中不同的代谢途径和环境胁迫而进化的结果［4］。

菊科中含有多种芳香族植物，其中青蒿属(Artemisiaannua)植物能产生一种倍半萜内酯过氧化物—青蒿素，青蒿素是目前世界公认的抗疟疾首选药物。紫穗槐-4，11-二烯(Amorphadiene)合酶是一种来源于青蒿的细胞色素P450单加氧CYP71AV1，它是一种多功能倍半萜内酯环化酶，能将萜类前体法尼基焦磷酸(FPP)氧化成紫穗槐-4，11-二烯(Amorpha-4，11-diene)，并进一步氧化成青蒿素合成的前体青蒿酸(Artemisinic acid)［5］。同时青蒿中还含有大量其他萜类化合物，青蒿植物精油主要成分包括单萜和倍半萜［6-7］。因此，了解青蒿P450，对于进一步了解P450在植物初生代谢和次生代谢中的作用具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所采用的青蒿(A.annua)P450氨基酸序列下载自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein/?term=Artemisia+P450)蛋白质数据库，水稻(Oryzas ativa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana) P450氨基酸序列下载自P450蛋白质数据库 (http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html)。

1.2 方法

1.2.1 菊科植物青蒿P450基因的鉴定 从NCBI蛋白质数据库中下载菊科植物青蒿中所有的P450全长序列，对其逐一进行氨基酸的一致性鉴定。对还没有进行家族分类的P450进行NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，结合下载的拟南芥和水稻序列寻找与其一致性较高序列。根据国际命名标准对其进行分类:氨基酸序列一致性(Identity)在40%至55%之间的序列为同一家族(Family)，一致性为55%～97%的序列归入同一亚家族(Subfamily)，氨基酸序列的一致性大于97%的序列是由同一基因的不同位点即等位基因编码［8］。

1.2.2 菊科植物青蒿P450系统进化树的构建 根据青蒿P450的氨基酸序列，通过MUSCLE［9］对所鉴定的P450氨基酸序列进行比对，采用MEGA 6.0软件Neighbor joining法构建进化树，重复次数为1 000次［10］。

1.2.3 青蒿和拟南芥、水稻P450系统进化树对比

在水稻和拟南芥P450中选择在青蒿中存在的11个家族所有P450全长氨基酸序列，采用MEGA 6.0软件中Neighbor joining法对已鉴定的青蒿中氨基酸序列一起构建系统发育树，重复次数为1 000次［10］。

1.2.4 青蒿P450蛋白质结构分析

1.2.4.1 青蒿P450蛋白质一级结构理化特性分析

利用在线软件Protparam(http://web.expasy.org/ protparam)对氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、分子式、脂肪族氨基酸、蛋白质疏水性、不稳定系数等蛋白质一级结构理化特性进行分析。

1.2.4.2 青蒿P450蛋白质亚细胞定位和信号肽预测 使用 TargetP在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对青蒿 P450蛋白质进行亚细胞定位［11］。信号肽预测使用在线软件SingaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行［12］。

1.2.4.3 青蒿P450蛋白质的二级结构分析 利用ExPaSy在线程序SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测分析α-螺旋、β-折叠、转角等;蛋白质晶体结构信息来源于 RCSB PBD(http://www.rcsb.org)，共 4个细菌 P450［P450cam(CYP101)、P450BM3(CYP102)、P450eryF(CYP107A1)和P450terP(CYP108)］，1 个 哺 乳 动 物 P450 (CYP2C5)，1个拟南芥丙二烯氧化合酶(CYP74A，)1个灰白银胶菊(Parthenium argentatum)丙二烯氧化合酶AOS(CYP74A2)［13］。将6个氨基酸序列与青蒿的P450用ClustalW软件进行同源比对，选择一致性较高的P450(CYP2C5)为模板［14］，应用在线ESPript程序(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)进行二级结构及基质结合位点的的预测［15］。

2 结果与分析

2.1 菊科植物青蒿P450基因的鉴定结果

从NCBI蛋白质数据库中共下载76条青蒿P450蛋白质氨基酸序列。其中具有全长的氨基酸序列57条，包含8条P450还原酶蛋白质氨基酸序列。将剩余的49条序列进行氨基酸的一致性鉴定，最后获得41个编码细胞色素P450单加氧酶的基因(表1)，其中有14个基因目前没有经过正式的家族分类。对没有分类的P450进行NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并结合下载的拟南芥和水稻P450氨基酸序列找到与其一致性较高的序列，对其进行进一步确认，鉴定结果见表2。

2.2 青蒿P450基因系统进化

从青蒿P450系统进化树(图1)可以看出，青蒿的41个基因分布相对集中，共分布在3个基因簇的11个家族中。其中 Clan72中的 CYP72有2个，Clan85中的CYP90有1个，CYP716有4个。其余全部分布于Clan 71中，且大多集中在CYP71家族中。来源于青蒿中的16个基因，除AaABG49366.1外，都在一个分支中，一致性在97%～99%，在分类上被视为同一基因的等位基因［8］。来源于青蒿属的其他物种的P450一致性为82%～86%。

表1 预测的青蒿细胞色素P450基因分布Table 1 Distribution of the P450 genes from Artemisia annua

表2 预测的青蒿细胞色素P450与其同源序列的一致性Table 2 Similarity of P450 amino acid sequence from A.annua and other species

2.3 青蒿、拟南芥和水稻P450系统进化树的对比

从青蒿和拟南芥和水稻的P450系统进化树(图2)中可以看出，双子叶植物拟南芥中所特有的［21］，水稻中不存在的CYP82、CYP83和CYP716 3个家族在青蒿中都出现了。有趣的是在拟南芥中不存在，而在单子叶植物中特有的CYP92家族居然在青蒿中出现。而Nelson等［21］提到的菊科中出现的8个家族 CYP73、CYP75、CYP76、CYP81、CYP93、CYP701、CYP74、CYP87，在青蒿中只有 CYP73和CYP81 2个家族出现。

2.4 青蒿P450蛋白质的结构特性

选择代表不同家族和亚家族的19个青蒿P450分析其特征特性。代表性P450氨基酸数为473～528，平均为500;相对分子量在53 977.9至61 127.3之间，平均为56 882.1(表3)。根据理论等电点(pI)将青蒿P450蛋白质分为2类:一类呈酸性，pI值介于6.00和6.69之间，包括CYP706、CYP83和 CYP82共3个家族中的5个蛋白质;另一类呈碱性，pI值介于8.03和9.25之间，包括CYP90、CYP716、CYP73、CYP72、CYP92、CYP71、CYP81、CYP98共8个家族中的14个蛋白质。不稳定指数介于32.19和42.58之间，平均值为39.64，总体上青蒿P450稳定性不太好。脂溶性指数在89.75和102.11之间，平均值也高达96.37，而其亲水性指数皆为负值，故青蒿P450都是亲脂性蛋白质。从表3可以看出，青蒿 P450中除 ADO16185.1(CYP92A)、ABC94480.1(CYP706)、ADO16181.1(CYP73A)外，其余都是分泌途径中的蛋白质。信号肽分析结果表明，除ADO16181.1(CYP73A)外，其余都含有跨膜区，为跨膜蛋白质。

图1 青蒿P450基因系统进化树Fig.1 The phylogenetic tree of P450 from A.annua

利用在线程序SOPMA进行二级结构预测。结果(表3)表明，本研究所涉及的P450家族蛋白质二级结构以α-螺旋为主要构成元件，平均所占比例达39.64%，其次是无规则卷曲、β-折叠和转角，平均所占比例分别为28.48%、16.57%和8.28%。以编号为BAM68808.1的蛋白质为例，绘制蛋白质二级结构(图3)。从图3中可见，α-螺旋为主要构成元件，无规则卷曲、β-折叠和转角分散在整个蛋白质中。

表3 青蒿P450家族蛋白质的生物信息Table 3 The biological information of P450 protein from A.annua

利用ESPript在线程序对青蒿P450进行同源比对和二级结构预测，发现青蒿P450一级结构同源性不高，但它们却有着非常类似的二级结构(图3)。将这些序列与CYP2C5(1DT6)的X-射线晶体结构图比对，发现有6个基质识别位点(SRSs)，且所有基质结合位点都分布在不同结构元件中，识别特异的底物。所有青蒿P450都含有典型的保守结构域: PERF结构域(PxRx)、K螺旋(ExxR)、C末端的血红素结合域(FxxGxxxCxG)以及N端的跨膜区(图4)。血红素结合域是P450蛋白的特征结构，该结构域中存在与铁元素形成硫醇盐离子键的绝对保守的半胱氨酸残基。二级结构预测结果表明，青蒿中不同P450氨基酸序列间存在严格的保守基序，这些保守的基序通常分散于P450氨基酸序列中的5个区域，它们与血红素结合区(FXXGXXXCXG)，共同组成保守的P450结构中心［14］。

图2 青蒿、拟南芥和水稻的P450系统进化树Fig.2 The phylogenetic tree ofP450 from A.annua，Arabidopsis and rice

图3 利用程序SOPMA进行青蒿P450蛋白质(BAM68808.1)二级结构预测Fig.3 Prediction of secondary structure of P450(BAM68808.1)from A.annua by SOPMA

图4 利用程序ESPript进行青蒿P450蛋白质二级结构预测Fig.4 Prediction of secondary structure of P450 from A.annua using ESPript

3 讨论

P450 是生物界无处不在的超级大家族，植物P450 超家族被归为10个基因簇，127个家族，其中水稻中有48个家族，拟南芥中有45个家族［21-22］，有9个家族是双子叶植物拟南芥所特有的，10个家族是单子叶植物水稻所特有。本研究共鉴定了41个青蒿P450，分布在3个基因簇的11个家族中。有趣的是，作为双子叶植物的青蒿，目前鉴定的仅有的11个家族中，既包括了拟南芥所特有的3个家族CYP82、CYP83和CYP716，又包括了水稻特有的1个家族CYP92。而Nelson等提到的菊科中出现的8个家族中［21］，只有CYP73和CYP81 2个家族出现。造成这种现象的原因，主要是由于拟南芥和水稻的基因组测序已经完成，其P450的鉴定已趋于饱和，而菊科基因组的研究还远远落后于拟南芥和水稻，故还会有新的P450不断补充。另一方面，也提示我们菊科植物作为一个古老的物种，有着更为丰富的P450家族蛋白质有待开发、鉴定。

所有的P450蛋白质都呈现相似的二级结构，尽管它们的序列一致性不高(低于20%)［23］。为了更好地理解P450结构和功能之间的关系，我们以CYP2C5(1DT6)的X-射线晶体结构图为模板［14］，对青蒿P450进行了氨基酸序列联配和次级结构元件的预测。发现所有的青蒿P450都含有典型的保守结构域，包括PERF结构域(PxRx)、K螺旋(ExxR)和C末端的血红素结合域(FxxGxxxCxG)，另外某些氨基酸残基也具有高度的保守性，这些保守结构域在蛋白质的折叠、组装中起着关键性作用［14］。而可变区主要出现在基质结合区。P450是最大的酶家族之一，能催化多种底物，这就需要该蛋白质能结合多种底物，行使各自的功能。

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