郏县红牛同期发情及超数排卵的研究

1 材料和方法

1.1 供试动物

试验于2010年12月～2012年12月在河南省平顶山市羴牛畜禽良种繁育公司郏县红牛繁育中心进行。

75头头胎经产纯种郏县红牛，均筛选自郏县红牛繁育中心，分三批，2010年12月30头， 2011年11月20头，2012年12月25头；每批次分组用进口促卵泡素(FSH)与国产促卵泡素(FSH)。

试验期间，所有供试母牛均提前1个月检查，选取性周期正常、无生殖器官疾病、膘情适中的母牛。供试母牛全部舍饲，以青粗饲料搭配精料饲喂，并提前1个月进行强饲，同时补充维生素和矿物质。

所用精液均采自平顶山市郏县红牛繁育中心合格公牛，制作细管活力在0.35以上。

1.2 仪器及设备

磁力搅拌器购自金坛市大地自动化仪器厂；CL-5500胚胎冷冻仪购自北京毕特博生物技术有限责任公司；XTL-1实体显微镜购自北京泰克仪器有限公司；显微镜恒温板购自金坛市大地自动化仪器厂；恒温水浴锅购自北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 试剂及药品

磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自GIBCO 公司，氯前列烯醇(PG，0.2 mg/支)购自上海计划生育科学研究所，促卵泡素(FSH，20 mg/mL)购自贝尔尼奇(加拿大)动物保健有限公司贝尔默实验室，促卵泡素(FSH，10 mg/瓶)购自中科院动物研究所，促排3号(20 μg/支Lot No.20080703)购自宁波市激素制品有限公司，孕激素阴道栓(CIDR)购自新西兰InterAg公司，牛血清白蛋白(BSA)Lot No.0305购自华美生物工程公司。

特级胎牛血清(FBS)(Lot No.041104yk3)购自中国医学科学院生物工程研究所。

1.3 试验方法

1.3.1 试验牛同期发情处理

(1) CIDR+PG法在发情周期的任一天放置CIDR栓，记为第1 d，第12 d下午撤栓，撤栓的同时肌肉注射PG 0.4 mg/头，之后观察发情，准确记录发情时间并统计发情率。

(2) 肌肉注射PG二次法在发情周期的任一天肌注PG 0.4 mg/头，记为第1 d，第12 d下午再肌注PG 0.4 mg/头，之后观察发情，准确记录发情时间并统计发情率。

1.3.2 试验牛的超排处理

(1)超排流程在发情周期的任一天放置CIDR栓，或第一次肌注PG，记为第1 d，第10 d开始递减剂量肌注FSH，准确区分记录注射国产FSH和进口FSH牛号，每日2次，间隔时间12 h，连续4 d，每头供体母牛注射FSH总量360 mg。第6次注射FSH的同时，再肌注氯前列烯醇(PG)0.4 mg/头。试验放栓的牛第12 d下午撤栓。观察发情，发情牛输精2次，间隔12h，每次输2支细管冻精。

(2)国产FSH和进口FSH的使用

在超排过程中，不同FSH的使用方法相同，其中郏县红牛供体母牛中的50头从第10 d开始连续四天递减剂量肌肉注射国产FSH(中科院动物所产，规格10 mg/支)，对照组25头郏县红牛供体母牛连续四天递减剂量肌肉注射进口FSH(加拿大产，规格20 mg/mL)。

1.3.3 非手术法冲胚输精后6～7 d进行冲胚。冲胚前直肠检查供体牛的超排反应情况，同时记录左、右侧黄体数和黄体总数。使用三通式采胚管进行非手术法冲胚，每侧子宫角各用500ml冲卵液冲洗7-8次，子宫回流液静置后实体显微镜下检胚。统计左、右侧黄体数，黄体总数和获胚数，应用SAS8.0软件分析处理实验数据。

1.3.4 胚胎的净化将胚胎集中在一起，移入保存液中，分别从一个液滴移入另一个液滴中进行净化，共3遍。这些液滴均为预先平衡1 h的保存液液滴。

1.3.5 胚胎的鉴定首先剔除明显退化胚胎和未受精卵，然后进行分级(图1)。在7～40倍实体显微镜下观察胚胎的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等，详细记录胚胎捡胚表。

图1a A级与B级可用胚胎图1b C级和C级以下不可用胚胎

胚胎等级鉴定标准

A级胚胎：形态典型，卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质致密，色调和分布极均一。

B级胚胎：与典型的胚胎相比，稍有变形，但卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质较致，分布均匀，变性细胞和水泡不超过10%～30%。

C级胚胎：形态有明显变异，卵细胞和分裂球轮廓稍不清晰，或部分不清晰，细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，突出的细胞、水泡和变性细胞占20%～50%。

1.3.6 胚胎冷冻收集到的可用胚胎转入胚胎保护液中，吸入2.5 mm细管以三段法装管，放入冷冻仪中冷冻，当温度降到-5～7℃进行植冰，然后继续冷冻，降温到-30～35℃，投入液氮保存。

2 结果与分析

2.1 两种同期发情效果的比较

由表1可见，PG二次法处理的同期发情率为76%，而CIDR+PG法的同期发情率为100%，二者差异显著(P<0.05)。

2.2 郏县红牛总体超排效果比较

由表2可见，应用连续4d递减肌注FSH法对郏县红牛供体牛进行超排处理，获得头均黄体数9.89个，头均获胚数7.05枚，头均获可用胚数4.53枚。

2.3 进口FSH与国产FSH对超排效果的影响

由表3可见，采用加拿大进口和中科院动物所生产的FSH进行超排，二者获得的头均黄体数分别为14.00个和7.29个，差异显著(P<0.05)，头均获胚数分别为6.33枚和6.00枚，差异不显著(P>0.05)。

表1 不同同期发情处理方法对郏县红牛同期发情效果的影响

注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。

表2 郏县红牛总体超排效果比较

注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表3 进口与国产FSH对供体超排效果的比较

3 讨论

3.1 不同同期发情处理方法对郏县红牛供体母牛同期发情效果的影响

氯前列烯醇(PG)具有溶解黄体的作用，但它只对母牛发情周期5～18 d的黄体有溶解作用，而对发情前后3～5 d则无溶解功能。因此，PG二次法处理后仍有部分母牛无反应。本研究结果显示，PG二次法处理郏县红牛同期发情率为76.0%，这与所选牛群的个体差异有一定的关系。

试验中孕酮阴道栓(CIDR)在供体体内持续分泌孕酮，维持血液中孕酮的高水平，抑制卵泡的生长。当同时撤栓后，卵泡生长的抑制因素被解除，为卵泡的生长提供了一个共同的起点，具有良好的同期发情效果，但是，有些个体在撤栓时黄体还未退化，这样在撤栓后黄体继续分泌孕酮，达不到发情同期化的效果。针对这种情况，在撤栓后肌注PG，从而达到溶解黄体的目的，在一定程度上提高了同期发情的效果。本研究中郏县红牛撤栓后再肌注PG，同期发情率为100%。应用PG二次法和CIDR+PG法对郏县红牛进行同期发情处理，同期发情率分别为76%和100%，两者差异显著(P<0.05)。本研究CIDR+PG处理法的同期发情率显著高于PG二次法，同期发情效果明显且理想，但是PG二次法在生产操作上，只需肌肉注射，并注意注射剂量一定要到位，操作相对简单；一支氯前列烯醇(PG，0.2 mg/支)价格为3.5元，按76%发情率计算，单头牛药物成本为：18.4元，而CIDR+PG法生产操作上，需要在阴道投放孕激素阴道栓(CIDR)和肌肉注射，一支CIDR价格为56元，按100%发情率计算，单头牛药物成本为：59.5元。所以在PG二次法具有更高的性价比，也便于生产操作。

3.2 郏县红牛超数排卵研究

据资料统计，晋南牛头均可用胚数3.94枚[7]、温岭高峰牛3.04枚[8]、青海黄牛4.00枚[9]、秦川牛4.20枚[10]、南阳牛4.28枚[11]、郏县红牛4.28枚，本研究共有效超排郏县红牛供体牛67头次，获得头均黄体数9.89个，头均获可用胚数4.53枚。说明本研究所采用的超排方法处理郏县红牛是可行的。但是，在相同的饲养环境下，相同的技术方案，相同的技术条件下，每次生产中总有个体一次贡献15枚左右的可用胚胎，因此，郏县红牛的超数排卵效果仍有待进一步提高。

3.3 国产与进口FSH对超排效果的影响

现阶段国内牛超排常用的FSH有进口和国产两大类。进口FSH价格高，但效果和稳定性高于国产产品。国产FSH价格低，从成本方面考虑有一定的优势。本试验研究同时选用加拿大进口和国内中科院动物所生产的FSH进行超排，结果表明在对郏县红牛超排处理后，进口FSH获得的头均黄体总数14.00±1.00个与国产FSH 7.29±5.56个差异显著(P<0.05)，而进口FSH的头均获胚总数6.33±5.08枚与国产FSH的6.00±5.71枚差异不显著(P>0.05)。进口FSH的超排效果明显稳定，但考虑到成本因素，生产中可以选用国产FSH对郏县红牛进行超数排卵。

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Study on Synchronization Estrus and Superovulation in Jiaxian Red Cattle

LI Zhi-gang1,2,WANG Xin-zhuang1*,YU Wen-hao1,SHI Kui-lin2,QIN Rui-feng1,2,SHI Yu-min2,ZHAI Ming-sheng1, LIU Yuan-zhe1

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,ZhengzhouHenan450002,China;2.JiaxianRedCattleBreedingCenter,Pingdingshan,Henan, 467000,China)

【Objective】In order to study the method of synchronization estrus and superovulation during the production of Jiaxian red cattle. 【Method】 A total of 75 heads of Jiaxian red cattle were divided to some groups and were treated by synchronization estrus and superovulation in turn. 【Result】 The results showed that synchronization estrus rate of cows that treated with the "CIDR plus PG" method was 100%, which was significantly higher than that of cows that treated with the "PG plus PG" method (76%) (P<0.05). The average embryos of the imported (Canada) FSH were 6.33, which was no significant difference with that of the domestic (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences) FSH (6.00) (P>0.05). 【Conclusion】 The effect of synchronization estrus in Jiaxian red Cattle treated with the "CIDR plus PG" method was better than another one; The imported (Canada) FSH and the domestic (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences) FSH demonstrated similar effects on superovulation in Jiaxian red cattle.

Jiaxian Red Cattle; Synchronization Estrus; Superovulation