鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与耐药性相关性研究

西安市中心医院呼吸内科(西安710003)

黄妙毅 刘 安



鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与耐药性相关性研究

西安市中心医院呼吸内科(西安710003)

黄妙毅 刘 安

目的：探讨鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与其耐药性的相关性。方法：对分离得到的鲍曼不动杆菌160株,采用黏附半定量法测量生物膜形成能力,比较不同生物膜形成能力的鲍曼不动杆菌对美罗培南、亚胺培南、头孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南及哌拉西啉他唑巴坦9种抗菌药物的耐药性影响。结果：160株鲍曼不动杆菌中96株为多重耐药菌(60%),59株为泛耐药菌(36.89%)。149株具有生物膜形成能力(93.13%),其中弱阳性36株,阳性52株,强阳性61株。随着生物膜形成能力的增强(弱阳性、阳性、强阳性),鲍曼不动杆菌对亚胺培南(50%、75%、81.96%)、左氧氟沙星(44.44%、53.85%、70.49%)、氨曲南(63.89%、88.46%、90.16%)的耐药率显著增强。结论：鲍曼不动杆菌生物膜形成能力较强，随着生物膜形成能力的增强,其对亚胺培南、左氧氟沙星及氨曲南耐药性增强。

鲍曼不动杆菌是一种非发酵的革兰阴性杆菌,它广泛分布于自然界和医院环境中，是导致医院感染最常见的条件致病菌之一,可引起呼吸机相关性肺炎、导管相关性血流感染、脑膜炎、泌尿系感染及伤口感染等,近年来它已经成为医院感染的主要致病菌,且耐药情况严峻[1]。越来越多的研究发现,鲍曼不动杆菌的耐药性与其细菌的生物膜有着密切的关系[2]。本研究对我院临床分离的160株鲍曼不动杆菌生物膜形成情况以及生物膜形成能力与耐药性的关系进行探讨,现报道如下。

材料与方法

1 菌株来源 2014年1～12月我院住院患者标本中分离的鲍曼不动杆菌,剔除同一患者中同一部位分离的重复菌株,共160株,其中痰液110株,支气管分泌物26株,伤口分泌物12株,引流液5株,尿液3株,血液2株,脑脊液2株。

2 药敏试验 采用VITEK2系统对病原菌进行分析鉴定及最低抑菌浓度(MIC)测定,采用纸片扩散法(K-B法)测定抑菌圈直径,根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2012年标准判定细菌耐药性,铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株。测试抗菌药物为美罗培南、亚胺培南、头孢哌酮舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南及哌拉西啉他唑巴坦9种。

3 生物膜的培养及测定[3-4]将菌株划线培养于麦康凯培养基上,37℃过夜振荡培养,第2日挑取单菌落放至含4 ml溶菌肉汤(LB)液体培养基的试管中,置于恒温震荡器37℃振荡培养18 h,用新鲜LB液体培养基将菌液配制成1.5×108cfu/ml的菌悬液,将菌悬液接种于96孔聚苯乙烯板上,每孔加入菌液200μl,设4个复孔,静置于25℃细菌培养箱中培养48 h,吸出上清液,用PBS清洗2次去除浮游菌,固定液固定,PBS清洗,加入0.1%结晶紫染料,染色15 min,吸出染液,PBS清洗,每孔加入95%乙醇200μl,溶解结晶紫,用酶标仪检测各孔在波长570 nm处的吸光度(A)值,未加菌液的空白培养基均值为Ac。将菌株生物膜的形成能力分为4类：A≤Ac为阴性(-)；Ac4Ac为强阳性()。

4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件分析数据,计数资料采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 鲍曼不动杆菌耐药情况测定 见表1。160株鲍曼不动杆菌中96株为多重耐药菌(60%),59株为泛耐药菌(36.89%)。

表1 160株鲍曼不动杆菌对9种抗菌药物耐药性 (%)

2 生物膜形成能力与耐药性分析 见表2。149株具有生物膜形成能力(93.13%),其中弱阳性36株,阳性52株,强阳性61株。鲍曼不动杆菌对亚胺培南、头孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星及氨曲南的耐药性在不同生物膜强度组差异有统计学意义 (均P<0.05)。随着生物膜形成能力的增强,对亚胺培南、左氧氟沙星、氨曲南的耐药率显著增强,其他药物则无相关性。

表2 鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与其耐药性 [株(%)]

讨 论

鲍曼不动杆菌已经成为近年引起医院获得性感染的主要病原菌之一，随着广谱抗菌药物的广泛应用，多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌逐年增多,增加了临床治疗难度,鲍曼不动杆菌感染后病死率逐年上升,本研究收集的160株鲍曼不动杆菌中96株为多重耐药菌(60%),59株为泛耐药菌(36.89%),除头孢哌酮舒巴坦耐药率较低，其他药物耐药率均在50%以上,耐药情况严峻。

近年来,国内外学者研究发现,生物膜与鲍曼不动杆菌的耐药性密切相关，细菌生物膜是指细菌在不利于其生长的环境下，通过自身产生的胞外多糖被膜多聚物相互粘连形成的细菌群落,本实验采用96孔板上培养48 h后测定生物膜形成能力,发现93.13%的鲍曼不动杆菌菌株能形成生物膜,有较强的生物膜形成能力。目前关于鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与耐药性的关系尚存在争议,Rao等[5]研究显示生物膜形成阳性菌株较阴性菌株对头孢噻肟、环丙沙星及氨曲南的耐药性增强；而Espinal等[6]研究发现生物膜形成能力与耐药性呈负相关。本研究发现鲍曼不动杆菌对亚胺培南、头孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星及氨曲南的耐药性在不同生物膜强度组有显著性差异。随着生物膜形成能力的增强，对亚胺培南、左氧氟沙星、氨曲南的耐药率显著增强，其他药物则无相关性。研究表明生物膜胞外多糖阻碍抗菌药物进入细菌内膜靶点,降低抗生素的作用[7],细菌生物膜内营养的缺乏使细菌生长与代谢较游离态缓慢,对常见抗生素不敏感[8]。生物膜内细菌的群体效应调节某些基因的表达而导致耐药,如外排泵的表达增强,能主动将抗生素泵出细菌外。多种机制参与了生物膜的耐药。

通过对我院分离得到的鲍曼不动杆菌的耐药性研究,发现生物被膜与鲍曼不动杆菌耐药性之间存在明显的相关性,但细菌耐药是多因素共同作用的结果，鲍曼不动杆菌生物膜内细菌有50%以上能表达与浮游细菌不同的特异性蛋白产物,产生生物膜独特表型,有报道称在生物膜的密闭系统中,生物信号诱导的基因表达水平可以提高20倍[9]。进一步在基因水平、蛋白水平探讨耐药性基因片段和生物膜形成的机制,才能更有效的治疗鲍曼不动杆菌感染。

[1] 尹变玲,刘 赟,陈葆青.呼吸系统疾病436例病原菌分布及其耐药性分析[J].陕西医学杂志,2014,43(9)： 1127-1129.

[2] Gurung J,Khyriem AB,Banik A,etal.Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumanniiand Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit[J].Indian J Crit Care Med,2013,17(4)：214-218.

[3] 王 政,刘 丁,黄冬梅,等.鲍曼不动杆菌临床分离株生物被膜形成能力与耐药性的研究[J].中国病原生物学杂志,2010,5(6)：405-407.

[4] Marti S,Rodrlguez-Bano J,Catel-Ferreira M,etal.Biofilmformation at the solid -liquid and air-liquid interfaces by Acinetobacter species[J].BMC Res Notes,2011,4：5.

[5] Rao RS,Karthika RU,Singh SP,etal.Correlation between biofilm production and multiple drug resistance in imipenem resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Indian J Med Microbiol,2010,26(4)：333-337.

[6] Espinal P,Marti S,Vila J.Effect of biofilm formation on the survival of Acinetobacter baumanniion dry surfaces[J].J Hosp Infect,2012,80(1)：56-60.

[7] 游 洋,顾伟杰,王 铮,等．鲍曼不动杆菌生物膜形成与耐药的相关性初探[J]．中国病原生物学杂志，2012，7(7)：500.

[8] Barth VC Jr,Rodrigues BG,Bonatto GD,etal.Heterogeneous persister cells formation in Acinetobacter baumannii[J].Plos One,2013,8(12)：84361.

[9] Rumbo-Feal S,Mez MJ,Gayoso C,etal.Whole transcriptome analysis of Acinetobacter baumannii assessed by RNA-sequencing reveals different mRNA expression profiles in biofilm compared to planktonic cells[J].PLos One,2013,8(8)：72968.

(收稿：2015-03-10)

细菌 生物膜 抗药性,多药,细菌 @鲍曼不动杆菌

R446.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.045