氧化苦参碱对子宫内膜癌细胞侵袭转移的抑制作用及其机制探讨*

西安交通大学第二附属医院(西安710004)

吴晓玲 蔡东阁 刘变利 孙师元 李 牧▲



氧化苦参碱对子宫内膜癌细胞侵袭转移的抑制作用及其机制探讨*

西安交通大学第二附属医院(西安710004)

吴晓玲蔡东阁刘变利 孙师元 李 牧▲

目的：探讨氧化苦参碱对人子宫内膜癌细胞HEC-1-B增殖、侵袭转移的作用及其机制。方法：MTT法检测细胞增殖抑制率；Transwell小室法观察细胞侵袭转移的改变；Western blot及Real-time PCR法检测p38、p-p38、MMP-2和MMP-9表达水平的变化。结果：一定浓度氧化苦参碱可显著抑制子宫内膜癌细胞HEC-1-B的增殖、侵袭转移,并呈时间和剂量依赖性。氧化苦参碱可显著降低HEC-1-B细胞中p38及MMPs的表达水平。联合应用SB203580能够有效增强氧化苦参碱的抗肿瘤细胞侵袭转移能力。结论：氧化苦参碱可以抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭转移,并下调p38磷酸化以及MMP2、MMP9的表达。

氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)是从中药苦参中提取的一种生物碱,具有抑制肿瘤细胞增殖和转移、促进凋亡,以及诱导分化等作用[1-2]。但有关OMT对人子宫内膜癌(EC)细胞增殖、侵袭能力影响的研究报道还较少。因此，本研究观察OMT对HEC-1-B细胞增殖、侵袭转移的影响，并初步探索其作用机制，为该药的临床应用提供理论依据。

材料和方法

1 细胞株及主要试剂 人HEC-1-B细胞为本实验室保存。DMEM培养基、胎牛血清及MTT购自美国Sigma公司，DMSO购自美国Amreseo公司,人工重构基底膜胶(Matrigel)购自美国BD公司,Transwell小室购自美国Corning公司,MMP-2、MMP-9和β-actin引物由TAKARA公司合成,抗p38及抗p-p38抗体购于美国Cell signal公司。

2 方 法 ①细胞培养：HEC-1-B细胞常规培养于含10%胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml的DMEM培养基,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。②MTT实验：将对数生长期的HEC-1-B细胞常规消化、重悬、接种于96孔板中(2×105个/ml),每组设6个复孔,培养24 h后,加入含有不同浓度(0、0.5、1.0、1.5 和2.0 mg/ml)OMT[3]的DMEM培养基,继续培养24 h、48 h、72 h后,加入20 μl MTT(5 mg/ml)/孔,4 h后弃去孔内培养液,加入DMSO 150 μl,震荡10 min后测量各孔的吸光值(A),计算细胞的生长抑制率：抑制率=(A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)×100%。③侵袭转移试验：Transwell小室用40 μl Matrigel胶包被后放入24孔培养板后,于上室中加入200μl细胞悬液(密度为1×106个/ml),下室中加入400 μl含20%胎牛血清的DMEM培养基，共分4组，在上室加入(0、0.5、1.0、1.5 mg/ml)OMT,每组平行设3个复孔,培养24 h,将小室底端的细胞固定、染色后,在200倍倒置显微镜下计数穿膜细胞,每张膜随机计算5个视野,取均值。④Real-time PCR试验：Trizol法提取细胞中总RNA，按照TAKARA公司反转录试剂盒合成cDNA,以cDNA为模板检测分析MMP-2、MMP-9和β-actin的表达情况，引物序列为：MMP-2(F:5’-TTCAGGTAATAGGCACCCTTGAAGA-3’；R：5’-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3’;MMP-9 (F：5’-GCCACCCGAGTGTAACCAT-3’；R：5’-GTCCACCCTTGTGCTCTTCC-3’)；β-actin (F：5’-CATGCCAATCTCATCTTGTTT-3’；R：5’- CCATCGTCCACCGCAAAT-3’)。按以下公式计算各基因mRNA表达率：mRNA表达率=(实验组mRNA相对值/对照组mRNA相对值)×100%。⑤Western blot：HEC-1-B细胞经不同浓度OMT处理24 h后，提取蛋白，Bradford法定量，取60 μg蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶(TBST配制)室温封闭1 h,一抗(p38 1∶1000,p-p38 1∶1000,β-actin 1∶1000)4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL暗室化学发光显影,用ImageJ 软件进行灰度分析。

3 统计学方法 所有数据以均数±标准差表示,用SPSS16.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验或方差分析(ANOVA),P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 OMT对HEC-1-B细胞增殖的抑制作用 MTT实验显示,OMT显著抑制HEC-1-B细胞的增殖，其抑制率随药物浓度升高、作用时间延长而逐渐升高,呈明显的剂量-时间依赖关系(图1)。

图1 OMT对HEC-1-B细胞的增殖抑制作用

2 OMT对HEC-1-B细胞侵袭力的影响 与对照组相比，不同浓度(0.5、1.0 和1.5 mg/ml)OMT作用HEC-1-B 细胞24 h后,穿过基底膜的细胞数受到显著抑制(图2A),细胞侵袭抑制率分别为58.4±4.8%,53.1±2.3%,22.5±1.8%,且呈剂量依赖性(图2B,P<0.01)。

图2 OMT对HEC-1-B细胞侵袭转移能力的影响

3 OMT对p38磷酸化水平及MMP-2和MMP-9 mRNA的影响 Western blot及Real-time PCR结果显示,不同浓度OMT(0.5、1.0 和1.5 mg/ml)对HEC-1-B 细胞进行处理后,p-p38蛋白、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平均明显低于对照组,而p38没有明显改变(图3A、B和C)；同时,OMT与SB203580联合应用对MMP-2和MMP-9 mRNA的抑制作用明显强于OMT单独作用(图3D,P<0.05)。

图3 OMT对HEC-1-B细胞中p38及MMP-2和MMP-9表达水平的影响

讨 论

OMT是一种广泛存在于苦参等中草药中的生物碱,其化学分子式为C15H24N2O,分子量为282,与苦参碱在一定条件下可以转化,研究发现OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒以及抗肿瘤等多种药理学作用[4]。侵袭转移是恶性肿瘤的主要生物学特征之一,涉及多环节、多步骤的过程,也是引起肿瘤治疗失败和死亡的主要原因之一。EC是是妇科三大恶性肿瘤之一，其侵袭转移的机制至今仍未完全明确,这也为其临床有效治疗带来困难[5]。我们发现在低于细胞毒性剂量的情况下OMT能显著抑制EC细胞的增殖、侵袭转移能力(图1、图2),这与以往研究结果一致。研究发现p38信号通路是苦参类药物作用的下游,可以通过调节MMP-2和MMP-9的表达发挥苦参类药物的作用[6-7]。我们也证实,OMT能够降低HEC-1-B细胞中p38信号通路的活性,抑制MMP-2和MMP-9 mRNA ,且与SB203580联合应用能显著增强OMT的抗侵袭转移的效应(图5)。

总之,OMT能抑制EC细胞株HEC-1-B细胞的增殖、侵袭转移能力,其作用机制可能与抑制p38信号通路的活性及下调MMP-2和MMP-9的表达有关,提示OMT确实具有抗肿瘤活性,有望成为新的预防EC侵袭转移的药物,值得我们进一步研究和开发。

[1] Li M,Su BS,Chang LH,etal.Oxymatrine induces apoptosis in human cervical cancer cells through guanine nucleotide depletion[J].Anticancer Drugs,2014,25(2)：161-173.

[2] Sun M,Cao H,Sun L,etal.Antitumor activities of kushen：literature review[J].Evid Based Complement Alternat Med,2012,12：373219.

[3] Zou J,Ran ZH,Xu Q,etal.Experimental study of the killing effects of oxymatrine on human colon cancer cell line SW1116[J].Chin J Dig Dis,2005,6(1)：15-20.

[4] 苏丽梅,戴贵东,聂黎虹,等.苦参碱对豚鼠离体胆囊平滑肌条收缩功能的影响[J].陕西中医,2010,31(7)：916-918.

[5] Dong P,Kaneuchi M,Konno Y,etal.Emerging therapeutic biomarkers in endometrial cancer[J].Biomed Res Int,2013,13：130362.

[6] Pan F,Ma S,Cao W,etal.SDF-1alpha upregulation of MMP-2 is mediated by p38 MAPK signaling in pancreatic cancer cell lines[J].Mol Biol Rep,2013,40(7)：4139-4146.

[7] 吴晓云,吕卫国.MMP-2和MMP-9在子宫内膜癌中的表达及其临床意义[J].浙江医学,2014,26(11)：816-817.

(收稿：2015-03-10)

Effects and mechanisms of oxymatrine on invasion and metastasis of endometrial carcinoma cells

Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Wu Xiaoling Cai DonggeLiu Bianli et al

Objective：To investigate the effects and mechanisms of oxymatrine on invasion and metastasis of Endometrial carcinoma HEC-1-B cells. Methods：HEC-1-B cells were cultured in vitro and treated by 0,0.5,1.0 and 1.5 mg/ml oxymatrine. Then cell growth curves assay and cell invasion assay using Transwell chamber was used to evaluate the effects of oxymatrine on invasion of HEC-1-B cells. The expression of p38,p-p38,matrix metalloproteinases-2(MMP-2) and MMP-9 were analysed by Western blot and Real-time PCR.Results：Compared with control group,oxymatrine (0.5,1.0 and 1.5 mg/ml) treated groups significantly inhibited the proliferation and invasive ability of HEC-1-B cells in a concentration-and time-dependent manner.In addition,oxymatrine reduced the phosphorylation level of p38 protein and the mRNA levels of MMP-2 and MMP-9. Moreover, a p38 inhibitor-SB203580 and oxymatrine excert synergistic inhibition effects on the expression of MMP-2 and MMP-9 in HEC-1-B cells. Conclusion：These findings suggest that a potential mechanism by which oxymatrine has an anti-metastatic effects on endometrial cancer cells via directly down-regulating the p38 signaling pathway.

Endometrial neoplasms Oxymatrine Neoplasm metastasis Gene expression regulation,neoplastic

*陕西省科技攻关计划项目(2014K11-01-01-18)

子宫内膜肿瘤 氧化苦参碱 肿瘤转移 基因表达调控,肿瘤

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.004

▲通讯作者