闭合性颅脑损伤大鼠血清和海马SAX2蛋白质谱的表达

赵彦功，舒清明，程 芮，白 皛，罗 敏，段媛媛

论 著

闭合性颅脑损伤大鼠血清和海马SAX2蛋白质谱的表达

赵彦功1，舒清明2，程 芮1，白 皛1，罗 敏1，段媛媛1

目的 研究闭合性颅脑损伤大鼠血清和海马SAX2蛋白质表达谱，探寻脑损伤生物标志蛋白。方法 选72只雄性SD大鼠随机分为手术对照组及损伤后4、8、12、24、48 h组，复制Marmarou落体打击大鼠脑损伤模型，分别进行常规HE染色、尼氏染色；并用强阴离子交换芯片(SAX2)质谱技术分析大鼠闭合性脑损伤后不同时间血清和海马中蛋白质表达谱的改变。结果 (1)SAX2芯片共获得530个血清蛋白质峰，147个海马蛋白质峰，6个组中，SAX2芯片在血清和海马中都能捕获的蛋白质数是14个。(2)血清中检测到的差异蛋白质，损伤后共有45个蛋白质峰的相对强度与手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；另有97个蛋白质峰在对照组中未检测到。(3)海马中检测到的差异蛋白质，损伤后共有18个蛋白质峰的相对强度与手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；另有40个蛋白质峰在对照组中未检测到。(4)在SAX2芯片上，血清和海马中均能检测到3656Da这一蛋白质，该蛋白质在血清中于损伤后4 h可以检测到，在海马中于损伤后12 h可检测到。结论 脑损伤可引起血清和海马SAX2蛋白质表达谱变化；血清和海马SAX2蛋白质表达谱存在差异，提示血清中出现的部分蛋白质可能为脑损伤诱导的血细胞基因表达产物；在血清和海马中检测到的差异蛋白质以及损伤后新出现的蛋白质峰，可能是脑损伤生物标志蛋白。

脑损伤；大鼠；SAX2蛋白质芯片；血清；海马

创伤对人类造成的威胁日趋严峻，已成为死亡的主要原因之一，尤其是创伤性脑损伤已成为伤病致死的重要病因。目前，有学者采用cDNA芯片技术研究外伤性脑损伤后基因表达在蛋白质谱的改变，实验结果表明外伤性脑损伤可引起不同部位的不同基因质谱表达的改变[1-4]。本实验采用SAX2蛋白质芯片研究脑损伤后脑组织和血液中蛋白质表达谱的差异，探寻脑损伤生物标志蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 SAX2蛋白质芯片、PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读机、生物芯片处理器(美国Ciphergen公司)。

1.1.2 主要试剂 SAX2芯片缓冲液(0.05%Triton x-100 in 50 Mm Tris-Hcl)。

1.2 方法

1.2.1 建立脑损伤模型 雄性SD大鼠72只(军事医学科学院实验动物中心提供)，体重350～450 g, 其中用于蛋白质芯片研究48只，常规病理学研究24只。采用成组设计随机分为手术对照组和损伤后4、8、12、24、48 h组，用于蛋白质芯片研究每组8只，病理学研究每组4只。打击前24 h在2%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔麻醉下切开头顶部皮肤，将不锈钢打击垫片固定在大鼠的颅骨穹隆部。打击时将大鼠置于厚海绵床上，以使大鼠头部能在打击后沿外力作用向前运动并避免颅脑局限性损伤。创伤的程度由改变坠落物的高度来调节。采用的落体重量450 g，高度1.5 m，复制Marmarou落体打击脑损伤模型[1]。手术对照组动物仅切开头顶部皮肤，将不锈钢打击垫片固定在大鼠的颅骨穹隆部，于术后24 h处死，取材及后处理同损伤组。

1.2.2 病理检查 对照组于埋置垫片后24 h，损伤组于打击后不同时间点，于海马齿状回互包平面行冠状切面，常规石蜡包埋、切片，切片厚5 μm，分别进行常规HE染色、尼氏染色。

1.2.3 蛋白质芯片检测

1.2.3.1 采血 手术对照组动物于埋置垫片后24 h，损伤组动物于打击后不同时间点在2%戊巴比妥钠(100 mg/kg体重)腹腔麻醉下开胸，左心室取血4 ml，冰上静置1 h后，5000 r/min离心10 min(0 ℃)；分离血清并以每份40 μl分装，-80 ℃冻存。样品前处理：融解冰冻血清，13 000 r/min离心10 min(4 ℃)；取20 μl血清，加入60 μl U9缓冲液，充分混匀，使蛋白变性，制成80 μl血清样品待用。

1.2.3.2 海马取材 手术对照组动物于埋置垫片后24 h，损伤组动物于打击后不同时间点在2%戊巴比妥钠(100 mg/kg体重)腹腔麻醉下断头处死，立即取双侧海马置-80 ℃保存。样品前处理：融解冰冻组织，每只大鼠取100 mg海马，放入匀浆器中加1 ml U9缓冲液和少量PMSF在冰上将组织匀浆，13 000 r/min离心10 min(4 ℃)；取上清750 μl置于2 ml专用离心管，40 000 r/min离心2 h(15 ℃)；分离上清液并以50 μl分装，冻存于-80 ℃。

1.2.3.3 血清样本SAX2蛋白芯片检测 将芯片装入生物芯片处理器，加100 μl 结合缓冲液，室温振荡孵育5 min，共3次。从上述80 μl蛋白变性后的血清样品中取40 μl样品，加入360 μl结合缓冲液混匀，取100 μl点样，于4 ℃振荡孵育1 h后除去样品。用150 μl洗脱缓冲液洗涤芯片2次，每次5 min，HPLC水冲洗1次，自然晾干芯片，加0.5 μl SPA 2次，表面干后，用蛋白质芯片阅读机进行蛋白质谱分析。

1.2.3.4 海马样本 SAX2蛋白芯片检测：将芯片装入生物芯片处理器，加200 μl 结合缓冲液，室温振荡孵育5 min，共2次。根据所测的样品蛋白质浓度用结合缓冲液稀释至0.8 mg/ml，取100μl点样，于4 ℃振荡孵育1 h后除去样品。用200 μl洗脱缓冲液洗涤芯片2次，每次5 min，HPLC水冲洗1次，自然晾干芯片，加0.5 μl SPA 2次，表面干后，用蛋白质芯片阅读机进行蛋白质谱分析。

1.3 统计学处理 蛋白质芯片检测结果采用Ciphergen proteinchip 3.0软件(美国Ciphergen公司)采集数据，用Biomarker Wizard分析软件对数据进行统计学处理，手术对照组与脑损伤后不同时间组之间蛋白质峰相对强度比较采用t检验，确定两组之间P<0.05时差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般表现 损伤组动物于打击后有42只大鼠(70%)出现抽搐并伴有呼吸暂停，持续约15 s；在没有出现抽搐的大鼠中有6只大鼠(10%)出现惊厥，持续约30 s；2只大鼠(3%)于打击后出现持续呼吸抑制和全身抽搐，几十秒钟后呼吸停止，死亡。10只大鼠(17%)伤后有肢体活动受限，表现为单肢或单侧肢体活动受限。

2.2 病理改变

2.2.1 大体改变 损伤组大鼠可见蛛网膜下腔出血，主要分布在脑底、小脑和脑干，无明显大面积挫伤或局灶性挫裂伤；切面可见胼胝体点状出血及双侧脑室出血。

2.2.2 组织学改变

2.2.2.1 常规HE染色 损伤组大鼠HE染色主要表现为额叶、顶叶、枕叶、小脑及脑干蛛网膜下腔出血，侧脑室出血，小挫伤灶。部分神经细胞胞体浓缩，胞核固缩，胞浆内尼氏小体消失呈同质性嗜酸性着色(红色神经细胞)；部分神经细胞胞体肿胀，胞质不规则淡染，核肿大淡染或消失。脑组织水肿，表现为脑组织疏松、神经细胞及血管周围间隙增大,脑干部分神经纤维增粗、呈波浪状改变。各损伤组海马区可见不同程度损伤，损伤后8 h达到高峰。

2.2.2.2 甲苯胺蓝尼氏染色 HE染色中所见的红色神经细胞，甲苯胺蓝染色呈深蓝色；HE染色胞体肿胀，尼氏小体减少或消失的细胞，甲苯胺蓝染色整个细胞呈淡蓝色。阳性细胞常呈灶状分布，与HE染色中红色神经细胞的分布基本一致。

2.3 蛋白质表达谱改变

2.3.1 蛋白质在不同芯片上的分布 采用PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读机，自动收集蛋白质峰，对位于2000～20 000的质荷比峰值,用Biomarker Wizard滤噪，设置初始滤噪值为5，第2次滤噪值为2，以0%为最小阈值进行聚类。所有原始数据先用Ciphergen proteinchip 3.0软件做校正(总离子强度及分子量均一化)。每个样品至少采用两个以上同类芯片检测，经分析表明平行蛋白质芯片之间的平均变异系数小于25%。除去基质峰，SAX2芯片共获得716个血清蛋白质峰；207个海马蛋白质峰(表 1)。SAX2芯片在血清和海马中都能捕获的蛋白质数是14个。

表1 闭合性颅脑损伤大鼠各组在血清和海马中检测到的蛋白质峰总数

注：括号中的数据包括与对照组相比有统计学意义的峰数和对照组没有检测到的峰数。

2.3.2 不同样本中检测到的差异蛋白质

2.3.2.1 血清中检测到的差异蛋白质 在SAX2芯片上，损伤后共有60个蛋白质峰的相对强度与手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；另有109个蛋白质峰在对照组未检测到(表2)。

2.3.2.2 海马中检测到的差异蛋白质 在SAX2芯片上，损伤后共有24个蛋白质峰的相对强度与手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；另有49个蛋白质峰在对照组未检测到(表2)。

表2 闭合性颅脑损伤大鼠各组中血清及海马检测到差异性蛋白质峰数

注：括号中的数据是闭合性颅脑损伤大鼠各组中血清及海马在手术对照组未检测到蛋白质峰数。

2.3.2.3 血清和海马中均能检测到的差异蛋白质 在SAX2芯片上，血清中有24个蛋白质峰在两个以上时间点都可以检测到，海马中有3个蛋白质峰在两个以上的时间点都可以检测到，血清中蛋白质3656 Da于损伤后4 h可以检测到，而在海马中于损伤后12 h可检测到(图1，2)。

图1 大鼠血清在不同损伤组中检测到的3656 Da蛋白表达图谱

图2 大鼠海马在不同损伤组中检测到的3656 Da蛋白表达图谱

3 讨 论

临床影像学是颅脑损伤的主要诊断方法，但微小 (<0.2 cm2)脑挫裂伤、脑震荡等闭合性颅脑损伤尚不能用CT和MRI等方法检测出来。为探讨脑损伤与血细胞基因表达的关系，目前有很多学者通过复制大鼠脑缺血、缺氧、出血、癫癎和低血糖模型，采用基因芯片(含8740个基因)技术检测不同动物模型24 h后血液单核细胞和全血细胞的基因表达谱，结果发现无论样本来自脑组织、白细胞还是全血，每种损伤都有独特的基因表达谱，提出脑损伤可诱导外周血细胞基因表达发生改变[2-6]。因此，通过检测外周血中蛋白质浓度寻找颅脑损伤的特异性标志物来反映脑损害的严重程度，具有一定的实际应用价值。

自由落体颅脑损伤模型可以复制临床上闭合性加速性颅脑损伤。这其中以Marmarou模型应用较为广泛[1]。本实验为研究脑损伤后蛋白质表达谱的改变，复制了Marmarou大鼠脑损伤模型。实验结果显示，损伤组动物中打击后出现抽搐并伴有呼吸暂停、惊厥、肢体活动受限，表现为单肢或单侧肢体活动受限。大体病理学改变主要表现为蛛网膜下腔出血，多累及脑底和脑干等部位。HE染色主要表现为额、顶、枕叶、小脑及脑干蛛网膜下腔出血，侧脑室出血，小挫伤灶，神经元变性坏死、水肿，以伤后8 h为重。甲苯胺蓝染色显示损伤后尼氏小体减少或消失。结果表明，脑损伤动物模型复制成功。鉴于海马对CNS的损伤最为敏感，作为前期探索性研究，笔者选取海马作为观察对象。

本实验选择了SAX2蛋白质芯片对大鼠脑损伤后4～48 h血清和海马蛋白质表达谱进行研究。SAX2芯片为强阴离子交换芯片，用于分析负电荷蛋白，阳离子和季胺集团构成活性位点，与样品中精氨酸、谷氨酸反应，选择性分析低等电点的蛋白质。在血清中，SAX2芯片共检测到530个蛋白质峰，在海马中，SAX2芯片共检测到147个蛋白质峰。在不同样本中检测到的差异蛋白质，与对照组相比，损伤组检测到的蛋白质峰相对强度有统计学意义的峰数中，血清多于海马。在所有的差异蛋白质中，在血清中有24个可以在两个或以上的时间点检测到，在海马中有3个可以在两个或以上的时间点检测到。脑损伤后蛋白质表达谱在血清中显示以上调为主，在海马中显示以下调为主，血清和脑组织中蛋白质表达谱存在差异。SAX2芯片在血清和海马中都能捕获的蛋白质数是1个，为3656 Da，于损伤后4 h在血清中先检测到，而在海马中于损伤后12 h才检测到。

从上述结果可以推断，在脑损伤发生和发展过程中，其细胞内的蛋白质变化在血清中可有改变；损伤后部分蛋白质在海马中出现先于血清中，还有部分蛋白质在损伤后血清中出现先于海马，可能是血脑屏障破坏、通透性增加、炎性反应、免疫反应和氧化反应等共同作用的结果。当然，并非所有脑损伤细胞内发生改变的蛋白质都可在血清中被检测出来。有些改变的蛋白质可能只存在于细胞内而不分泌或漏出到细胞外，这部分蛋白质可能是与脑损伤发生密切相关的功能蛋白和调节蛋白。大鼠脑损伤后无论是血清中还是海马中都能检测到上调和下调的蛋白质，上调的蛋白质中既可能有参与原发性损伤的，又可能有参与继发性损伤的，也可能有参与修复的。下调的蛋白质可能是损伤抑制的结果。

总之，脑损伤可引起血清和海马蛋白质表达谱变化。血清和海马蛋白质表达谱存在差异，提示血清中出现的部分蛋白质可能为脑损伤诱导的血细胞基因表达产物。在血清和海马中检测到的差异蛋白质，以及损伤后新出现的蛋白质峰，可能是脑损伤生物标志蛋白，可用于脑损伤的诊断和治疗。

[1] Marmarou A, Foda M A, vanden Brink W,etal. A new model of diffuse brain injury in rats[J].Neurosurg, 1994, 80:301-313.

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[3] 舒清明, 李灵芝, 李志强, 等. 大鼠机械性脑损伤蛋白质表达谱的变化及意义[J].中国实验诊断学, 2009,13(11): 1534-1538.

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[5] Tang Y, Nee A C, Lu A,etal. Blood genomic expression profile for neuronal injury[J]. Cereb Blood Flow Metab, 2003, 23:310-319.

[6] Wulfkuhle J D, Liotta L A, Petricoin E F. Proteomic applications for the early detection of cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3:267-275.

(2015-07-01收稿 2015-08-20修回)

(责任编辑 岳建华)

Alteration of SAX2 protein expression pattern in rat serum and hippocampus after closed head injury

ZHAO Yangong1，SHU Qingming2，CHENG Rui1，BAI Xiao1，LUO Min1，and DUAN Yuanyuan1.

1. Department No.1 of South Building，2.Department of Pathology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China

Objective To study the alteration of SAX2 protein expression pattern in rat serum and hippocampus after closed head injury and to find biomarkers of brain injury. Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group and injury groups which were subjected to Marmarou’s brain injury and then subdivided into 4 h、8 h、12 h、24 h and 48 h groups according to the time elapsed after injury. The pathological study included H&E staining and toluidine blue staining. The change of protein expression pattern in serum and hippocampus were monitored with strong anion exchange chips (SAX2). Results (1)A total of 530 protein peaks were detected on SAX2 chips in serum，and a total of 147 protein peaks in hippocampus. (2) Among the total of protein peaks detected, the relative intensity of 45 protein peaks was shown to be differentially altered on SAX2 chips in serum of injury groups, compared with sham operation group(P<0.05). There were 97 protein peaks in serum of injury groups, which could not be detected in sham operation group with SAX2 chips. (3) The relative intensity of 18 protein peaks was shown to be differentially altered on SAX2 chips in hippocampus of injury groups compared with sham operation group(P<0.05). There were 40 protein peaks in hippocampus of injury groups which could not be detected in sham operation group with SAX2 chips. (4) On SAX2 chips, only one protein(3656Da) peak was detected not only in serum but also in hippocampus. Conclusions The alteration of SAX2 protein expression patterns in serum and hippocampus can be induced after brain injury. The SAX2 protein expression patterns of serum and hippocampus after brain injury are different, which suggests that part of protein in serum can be a production of blood cells gene expression induced by brain injury. The distinct proteins detected in serum and hippocampus includ the proteins which are significant, compared with sham operation group and those which are not detected in sham operation group. They can be biomarkers of brain injury.

brain injury; rat; protein chip; serum; hippocampus

赵彦功，博士，副主任医师，E-mail: zhaoyangong@126.com

100039 北京，武警总医院：1.南楼一科，2.病理科

白 皛，E-mail: 3097895653@qq.com

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