牛心包生物补片对后巩膜加固区的生物力学特性及其作用机制

周希彬，黄一飞，吴志鸿，焦小杰

牛心包生物补片对后巩膜加固区的生物力学特性及其作用机制

周希彬1，黄一飞2，吴志鸿1，焦小杰1

目的 应用不同交联程度的牛心包生物补片行后巩膜加固术，观察实验动物巩膜加固区的力学特性，并进一步探讨后巩膜加固术的作用机制。方法 健康成年纯种新西兰白兔48只，雌雄不拘。体重2.2～2.5 kg，随机分为4组，每组12只。A组使用未交联的牛心包生物补片；B 组使用中度交联的牛心包生物补片；C组使用高度交联的牛心包生物补片；D组使用人巩膜组织。分别分为术后2、4、12、24周观察期。手术前常规裂隙灯、间接检眼镜检查，排除有眼部疾患的动物。同期手术,各组术眼为左眼。后巩膜加固材料为长条形，5 mm×20 mm，每眼植入1条。手术前后观察外眼(结膜水肿、炎性反应)、前节、眼底情况。各组手术后2、4、12、24周取标本，摘除眼球,洗净血污,切取植片包括其附着的巩膜。应用BOSE ElectroForce动态力学试验仪对各不同交联度牛心包补片及各实验组巩膜加固区进行生物力学检测。结果 随植入时间的延长，A、D组组织逐渐被降解吸收，至24周时已大部被吸收。B、C组组织无明显降解。A、D组术后4、12周巩膜加固区的弹性模量和刚度与术后2周相比明显增大，刚度及强度则随着术后时间延长而下降。B、C组术后24周巩膜加固区的弹性模量较其余各时间点减少，术后12周与24周组刚度明显降低，尤其以术后24周组刚度最弱。术后24周 B、C组刚度及强度明显高于A、D组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 交联后的牛心包机械强度大大提高，中、高度交联的牛心包均可用于后巩膜加固术，其远期效果优于人巩膜及未交联的牛心包。

牛心包；交联；生物力学；后巩膜加固

病理性近视又称变性近视，是以眼轴过度增长造成眼底后极部损害为特征的高度近视[1]。多数学者认为，后巩膜加固术是目前治疗病理性近视的唯一有效方法[2，3]。本研究制备不同交联程度的牛心包，与人巩膜组织对照，分析其生物力学特性，期望为临床提供来源丰富、安全可靠的后巩膜加固材料，以促进病理性近视手术治疗的开展。

1 材料与方法

1.1 后巩膜加固材料 (1)制备不同交联度的牛心包。将新鲜牛心包除尽脂肪组织，用无菌生理盐水于冰浴中反复冲净血污、漂洗。Triton-X-100/PBS溶液脱细胞处理后，分别以0.625%及0.25%戊二醛对其进行交联处理得到高强度及中等强度组交联牛心包；仅做脱细胞处理的牛心包材料作为未交联牛心包，制备后的牛心包双层密闭塑料袋无菌包装，γ射线灭菌后备用。(2)95%乙醇保存的新鲜人异体巩膜组织(由301医院眼科提供)。

1.2 实验动物及分组 健康成年纯种新西兰白兔48只，雌雄不拘,体重2.2～2.5 kg(动物均由解放军总医院实验动物中心提供)。随机分为4组，每组12只。A 组使用未交联的牛心包生物补片；B 组使用中度交联的牛心包生物补片；C组使用高度交联的牛心包生物补片；D组使用人巩膜组织。均取左眼为手术眼。

1.3 手术方法 术前将保存的牛心包组织置于500 ml生理盐水中浸泡5 min，冲洗3遍；人巩膜组织于生理盐水中浸泡复水。将后巩膜加固材料裁剪为长条形，5 mm×20 mm，每眼植入一条。氯胺酮50 mg/kg加地西泮10 mg/kg肌内注射麻醉，爱尔卡因眼液表面麻醉。常规消毒、铺无菌巾。开睑器开睑。自鼻侧经下方至颞侧角膜缘打开结膜,在巩膜表面用巩膜分离器钝性分离至后部，暴露内、外直肌及下斜肌，并分离之，勾取并分离下斜肌，将加固条带从下斜肌腹下穿过外直肌及下直肌, 拉紧缝合固定于巩膜表面。结膜伤口缝合,结膜囊内涂妥布霉素地塞米松眼膏。

1.4 观察指标及方法 手术后左氧氟沙星滴眼液滴眼，4次/d，持续7 d。手术后7 d内每天观察结膜伤口愈合情况，有无结膜水肿、炎性反应，植入物有无排异蚀出，瞳孔大小及用间接检眼镜检查眼底视神经是否损伤等。7 d后改为每7 d检查1 次，至实验结束。 各组分别于手术后2、4、12、24 周，静脉氯胺酮50 mg/kg加地西泮10 mg/kg肌肉注射麻醉，开睑器开睑，沿角膜缘360°剪开球结膜并向后分离，同时分离眼球筋膜，取兔眼标本。取材后过量注射地西泮处死动物。取加固植片及手术后兔巩膜行厚度及力学性能测试。用皮革测厚仪(PS83,苏州电子仪器公司)测定加固植片及手术后兔巩膜各3个试条，在每个试条的固定两点测定厚度，取平均值作为该试条的厚度。应用BOSE ElectroForce动态力学试验仪(S4800，美国Bose corporatron公司)对试条行极限抗拉强度试验，所有试件均直接于常温室内进行测试。测试条件如下：试样速度10 mm/min ，临界载荷5 N。试样标距10～18 mm ，试件宽度均为2.5 mm。试件拉断后，实验结束。采用Excel进行求解，对数据进行拟合整理后绘制载荷-位移曲线，确定载荷位移曲线中的线性部分。用slope函数确定刚度,用max函数确定断裂强度(图1)。设条带试件被实验部分长度为L，宽度记为W，厚度记为T，则横截面面积S=T×W；刚度为线性阶段的斜率：K(N/mm)=载荷增量/试件变形量；试件材料线性阶段的弹性模量(E):弹性模量(MPa)=刚度×试件长度/横截面积，即E=KL/S。断裂强度(Nmax)为试件被拉断时的最大拉力。

图1 巩膜加固区试件BOSE ElectroForce动态力学试验仪载荷-位移曲线

AB段基本呈线性关系，随后材料发生屈服，C点载荷达到最大，此点即为试件被拉断时的最大拉力即断裂强度(Nmax)

1.5 统计学处理 应用SPSS11.5医学统计软件中的单因素方差分析进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床及大体形态观察 术眼术后有轻微的结膜充血、水肿。术后2周术眼结膜充血、水肿完全消退，外观与正常眼无明显差别。观察期内未见分泌物增多，无植入物蚀出，未见炎性肉芽肿，眼底检查未见视网膜出血、水肿，视神经无水肿、萎缩。动物进食及活动无异常。

术后第2周各组植片贴附欠平整，部分与巩膜间有间隙，易与之分离。各组植片质软、边缘整齐，与新鲜组织类似，色泽无明显变化。术后第4周各组植片贴附平整，易与巩膜分离。A 组植片质软、疏松，边缘欠整齐，植片表面与筋膜粘连，易分离；D组植片质软、边缘整齐；B、C组牛心包植片色泽无明显变化，植片质软，边缘整齐。术后第12周 A、D 组植片明显变薄，肉眼能分辨植入物形态，植片质软、色泽与巩膜相似，植片与巩膜融合严密，分离困难。B、C组植入的牛心包植片无变薄，植片已经钙化变硬，色黄，与巩膜严密附着分离困难。各组植片平复整齐无变形。术后第24周 A、D 组肉眼不能分辨植入物形态，植片大部分已经降解吸收，仅残留有部分组织，附着于巩膜表面，或与筋膜组织粘连。B、C组植入的牛心包植片与巩膜严密附着不能分离和移动，植片质硬、色黄，肉眼仍能分辨清晰，植片平复整齐无变形。

2.2 加固区巩膜生物力学测试结果 各组不同时间点各种试件的弹性模量、断裂强度及刚度见表1～3。

由表1可见，B、C组术后24周巩膜加固区的弹性模量较其余各时间点减少。术后2周及24周各组之间弹性模量相近，但B、C组明显高于A、D组。由表2可见，A、D组强度随着术后时间延长而下降，术后4周、12周及24周B、C组断裂强度明显高于A、D组。由表3可见，B、C组术后12周、24周组刚度明显降低，尤其以术后24周组测得的刚度最弱，但术后2周、4周及24周B、C组断裂强度明显高于A、D组。

表1 不同材料组后巩膜加固术后2～24周巩膜加固区弹性模量比较 (n= 3；MPa； ±s)

注:A组使用未交联的牛心包生物补片；B组使用中度交联的牛心包生物补片；C组使用高度交联的牛心包生物补片；D组使用人巩膜组织。与本组2周相比较，①P<0.05；与本组其余各时间点比较，②P<0.05；与本组2周、4周比较，③P<0.05；术后2周B、C组与A、D组相比较，④P<0.05

表2 不同材料组后巩膜加固术后2～24周巩膜加固区断裂强度比较 (n= 3；N；±s)

注:A组使用未交联的牛心包生物补片；B 组使用中度交联的牛心包生物补片；C组使用高度交联的牛心包生物补片；D组使用人巩膜组织。与本组其余时间点相比较，①P<0.05； B组术后2周、4周相比较，②P<0.05； C组术后2周与4周、12周之间相比较，③P<0.05；与本组其余时间点相比较，④P<0.05；术后4周、12周、24周B、C组与A、D组相比较，⑤P<0.05

表3 不同材料组后巩膜加固术后2～24周巩膜加固区刚度比较 (n= 3；N/mm ；±s)

注:A 组使用未交联的牛心包生物补片；B 组使用中度交联的牛心包生物补片；C组使用高度交联的牛心包生物补片；D组使用人巩膜组织。①与本组其余时间点相比较P<0.05；②与本组其余时间点相比较P<0.05，二者相比较P<0.05；③术后2周、4周、24周B、C组与A、D组相比较P<0.05；④术后12周，A、C组相比较P<0.05

3 讨 论

牛心包生物补片生物耐受性良好，无明显毒性，作为异种生物材料是安全的[4-7]。

本研究应用不同交联程度的牛心包生物补片行后巩膜加固术，并与临床上最常采用的人巩膜组织对照，观察其降解及生物力学特性，发现术后第24周人巩膜与未交联的牛心包植片大部分已经降解吸收，仅残留有部分组织，附着于巩膜表面，或与筋膜组织粘连。说明人巩膜与未交联的牛心包植入宿主体内后，易被降解吸收，本研究未观察到其与宿主巩膜融合。此结果或可解释，临床上之所以出现后巩膜加固术后远期效果不满意，概因植片降解所致。因而人巩膜与未交联的牛心包早期植片组织内部虽有新生血管长入，能促进局部血液循环，改善局部脉络膜营养，但远期因降解而起不到巩膜加固作用。本研究亦发现，用人巩膜及未交联的牛心包行后巩膜加固术，抵抗拉伸变形的能力随术后时间延长减弱，术后24周则均恢复至术前水平。说明随着组织的降解吸收其生物力学方面显示加固作用亦随之消减，证明人巩膜及未交联的牛心包并非满意的后巩膜加固材料。

本研究发现，中、高度交联的牛心包组织弹性模量、断裂强度及刚度明显高于其他材料，尤以高度交联的牛心包组织为最高。说明经交联后的牛心包抵抗拉伸变形的能力及强度明显增强，且随交联度增加而增高。未经交联的牛心包组织抵抗拉伸变形的能力与兔巩膜组织及人巩膜组织相近。已知的研究表明牛心包的强度与其胶原纤维的构架是直接相关的，并且由于胶原纤维排列走向的多样性，导致牛心包的强度具有各向异性[8]，交联后胶原纤维排列更加致密，强度增加。牛心包经交联后，胶原纤维排列构架更加致密有序，这是其机械强度增加组织学基础。

未交联的牛心包应用于后巩膜加固术，术后4周、12周组巩膜加固区的弹性模量和刚度与术后2周组相比明显增大，刚度及强度随着术后时间延长而下降，说明在术后抵抗拉伸变形的能力随术后时间延长减弱，这与材料的降解有关。而应用中、高度交联的牛心包行后巩膜加固术，术后24周组巩膜加固区的弹性模量较其余各组减少，术后12周与24周组刚度明显降低，尤其以术后24周组刚度最弱。而中、高度交联的牛心包在术后第24周牛心包植片组织无明显降解，与巩膜严密附着不能分离和移动，生物力学实验发现，应用中、高度交联的牛心包行后巩膜加固术后巩膜加固区在术后24周抵抗拉伸变形的能力及强度仍然明显增强，说明植片能起到对抗拉伸变形的作用，应用于后巩膜加固术是可行的。

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(2014-11-19收稿 2015-01-20修回)

(责任编辑 梁秋野)

Biomechanical properties of bovine pericardium in posterior sclera reinforcement operation

ZHOU Xibin1, HUANG Yifei2， WU Zhihong1, and JIAO Xiaojie1.

1.Department of Ophthalmology, General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039, China;2. Department of Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Objective To evaluate the biomechanical properties of bovine pericardium (BP) after posterior sclera reinforcement operation (PSR)，and to investigate the mechanism of PSR further in the experimental animal and to provide reference for further clinical test and application. Methods Forty-eight New Zealand albino rabbits, weighing 2.2 to 2.5 kg, underwent posterior sclera reinforcement operation of the left eye. All eyes were examined preoperatively by slit lamp biomicroscopy and indirect ophthalmoscopy, and only healthy eyes were included in the experiment. Animals were randomized into 4 groups. For each group, one type of material was surgically implanted at the back of the globe. Group A: uncrosslinked BP(UBP) group, 12 rabbits; group B: moderate crosslinked BP MBP group, 12 rabbits. Group C: high crosslinked BP HBP group, 12 rabbits. Group D: human sclera group, 12 rabbits. The eyes were enucleated at the 2nd, 4th, 12th and 24th week after surgery respectively. The mechanic properties of four groups were evaluated by the BOSS ElectroForce BioDynamic test instruments. Results The patches in group A and D degraded with time and degraded mostly at the time of 24th week after surgery. The patches were intact in group B and C. Statistically significant difference in modulus of elasticity of implanted area of sclera samples was noticed between the time of 4th, 12th week and 2nd week after surgery in group A and D, and the stiffness and breaking strength decreased with time. The modulus of elasticity of implanted area of sclera in group B and C decreased at the 24th week after surgery, the stiffness decreased at the 12th and 24th week after surgery, especially at the time of 24th week. Statistically significant difference in stiffness and breaking strength was noticed between groups A, D and groups B, C at the time of 24th week after surgery. Conclusions The study revealed that MBP and HBP effectively enhances the anti-deformation capacity of the posterior sclera in rabbits and surpasses the BP without crosslink and human sclera . The MBP and HBP may add to our repertoire in preventing the development of progressive myopia.

Bovine pericardium; crosslink; Rabbits; Biomechanics; Scleroplasty

周希彬，博士，主治医师，E-mail:xibinzhou@163.com

1.100039 北京，武警总医院眼科；2.100853 北京，解放军总医院眼科

黄一飞，E-mail: 301yk@sina.com

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