冠心病介入术后氯吡格雷低反应性与CYP2C19基因多态性的关系

孙亚勤，杨胜利，杨 勇

冠心病介入术后氯吡格雷低反应性与CYP2C19基因多态性的关系

孙亚勤1，2，杨胜利2，杨 勇2

目的 探讨冠心病(coronary artery disease，CAD)介入术后氯吡格雷低反应发生与CYP2C19基因多态性的关系。方法 选取武警总医院心内科行经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI )患者200例，术后给予阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板药，并经血栓弹力图检测二磷酸腺苷(adenosine diphosphate， ADP)诱导的血小板抑制率，按ADP诱导的血小板抑制率是否小于30%，将患者分为氯吡格雷低反应组和氯吡格雷敏感组；同时采用基因芯片技术检测CYP2C19基因多态性，判断对氯吡格雷的反应性的影响。结果 CYP2C19*1/*1与CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*1与CYP2C19*2/*2、快与中间代谢型比较ADP的抑制率有统计学差异；共79例(39.5%)发生氯吡格雷低反应。氯吡格雷敏感组快代谢型者(基因型*1/*1)多于低反应组(P=0.013)，氯吡格雷低反应组中慢代谢型较多(P=0.013)，差异均有统计学意义。其他代谢型间比较无差异。结论 冠心病PCI术后氯吡格雷低反应与CYP2C19基因多态性相关，携带中慢代谢型基因者发生氯吡格雷低反应较多。

CYP2C19基因多态性；ADP诱导的血小板抑制率；冠心病

阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板药可治疗、预防冠心病缺血事件发生，显著提高急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)和经皮冠脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI) 临床预后。目前许多研究表明，冠心病PCI术后的部分患者即使给予常规剂量双联抗血小板药治疗仍有血栓事件发生，进行实验室血小板功能检测发现存在氯吡格雷低反应、无应答或抵抗。氯吡格雷属于前体药,经肝脏细胞色素酶P450(CYP450)(CYP2C19等编码)转化为有活性的硫醇代谢物，与血小板表面上ADP受体P2Y12结合抑制血小板聚集达到抗血小板作用[1]。CYP2C19在氯吡格雷激活中起着关键作用[2]。大量研究证明，CYP2C19功能缺失型等位基因携带者比非携带者血浆中抗血小板聚集作用的氯吡格雷活性代谢物显著降低，与氯吡格雷低反应相关，而且PCI术后1年内临床终点事件的风险明显增加。但同时亦有文献报道，CYP2C19基因多态性与氯吡格雷低反应无关，存在争议。

目前，国内外尚无明确统一的氯吡格雷低反应定义，本研究采用血栓弹力图检测二磷酸腺苷(adenosine diphosphate， ADP)诱导的血小板抑制率，参照文献[3]定义的氯吡格雷低反应为ADP诱导的血小板抑制率小于30%。通过基因芯片技术检测CYP2C19基因多态性，旨在探讨氯吡格雷低反应性与CYP2C19基因多态性的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2013-10至2014-10就诊于武警总医院心内科诊断为冠心病并行PCI术患者200例。入选标准:(1)汉族；(2)年龄≤80岁；(3)服用氯吡格雷(75 mg/d)≥7 d，ADP诱导的血小板聚集率出现稳定抑制。排除标准:(1)对阿司匹林或氯吡格雷过敏或不能耐受；(2)3个月内有脑卒中或内脏出血性疾病；(3)血小板的数量<80×109/L或>45×109/L，血红蛋白<80g/L，或有肝素诱导的血小板减少症；(4)严重的肝、肾功能损害及凝血功能障碍；(5)合并肿瘤、免疫系统疾病、感染性疾病；(6)1周内或近期拟行外科手术或具有抗血小板治疗禁忌证；(7)心源性休克；(8)有明确活动性消化性溃疡者及上消化道穿孔史者；(9)伴其他终末期疾病，预期寿命小于1年。

1.2 试剂与仪器 血小板抑制率测定使用5000型血栓弹力图凝血分析仪(美国Haemoscope 公司)。试剂:高岭土(含1% Kaolin 液)、激活剂和ADP均为美国Haemoscope公司产品。

1.3 方法

1.3.1 血小板抑制率检测 所有患者于氯吡格雷使用后7 d晨起时空腹抽取静脉血5 ml，置于含3.13%枸橼酸钠和肝素钾的采血管内，2 h 内应用TEG 凝血分析仪进行检测。参照文献氯吡格雷低反应的定义，根据血小板抑制率将患者分为氯吡格雷敏感组(MAADP≥30%)和氯吡格雷低反应组(MAADP<30%)[1]。

1.3.2 CYP2C19基因多态性检测 (1)样本收集、DNA 提取及聚合酶链反应扩增：研究对象于支架植入后第2天抽取静脉血1 ml置入乙二胺四乙酸二钠抗凝管中，按照上海百傲科技有限公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒要求提取和纯化DNA(DNA 的浓度10～60 ng/μl，A260/A280比值在1.5～2.0)。PCR扩增条件为：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。(2)杂交显色利用Baio基因芯片图像分析软件进行图像扫描与数据分析并输出检测结果。研究表明应用美芬妥英或CYP2C19底物作为表型探剂药物可把人类表达的CYP2C19分为三种表型，即快或强代谢型(extensive metabolizer，EM，基因型为CYP2C19*1/*1)、中间代谢型(intermediate metabolizer，IM，基因型为CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3)和慢(或弱)代谢型(poor metabolizer，PM，基因型为CYP2C19*2/*2、 CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3)。

2 结 果

2.1 一般资料对比 200例中，氯吡格雷低反应组79例，研究人群中氯吡格雷低反应的发生率为39.5%，其中男性84例(69.4%)；氯吡格雷敏感组121例，其中男性53例(67.1%)。两组临床资料中除射血分数、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血小板抑制率外，差异无统计学意义，具有可比性(表1)。

2.2 CYP2C19各基因型及代谢型间血小板抑制率比较 200例中有90例(45.0%)为纯合子快代谢型(CYP2C19*1/*1)。87例(43.5%)为杂合子中间代谢型，其中76例(38.0%)为CYP2C19*1/*2， 11例(5.5%)为CYP2C19*1/*3。23例(11.5%)为慢代谢型，其中18例(9.0%)为CYP2C19*2/*2，5例(2.5%)为CYP2C19*2/*3。经单因素方差分析：携带CYP2C19*1/*1与CYP2C19*1/*2(46.28±26.67vs38.58±21.99，P<0.05)、CYP2C19*1/*1与CYP2C19*2/*2(46.28±26.67vs33.18±25.01，P<0.05)、快代谢型与中间代谢型相比(46.28±26.67vs38.32±21.47)，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 冠心病介入治疗术后两组患者临床资料比较 ±s)]

2.3 CYP2C19基因型及代谢型间氯吡格雷反应性的比较 氯吡格雷低反应组与敏感组比较，氯吡格雷敏感组携带基因型*1/*1患者多于低反应组(P=0.013)，氯吡格雷低反应组中慢代谢型较多(P=0.013),差异有统计学意义，其他基因型及代谢型间差异无统计学意义，见表2。

表2 冠心病介入治疗术后两组CYP2C19各基因型与氯吡格雷反应性的关系 (n;%)

3 讨 论

氯吡格雷是临床常用的抗血小板药物,CAPRIE、CURE及COMMIT等一系列临床研究证明了其抗血小板药治疗的有效性和安全性:氯吡格雷可显著降低PCI术后各类血栓事件的发生率[4-6]。部分患者即使给予常规剂量双联抗血小板药治疗仍有血栓事件发生，进行实验室血小板功能检测发现存在氯吡格雷低反应、无应答或抵抗。氯吡格雷抵抗的发生机制尚不清楚, 由于缺乏特异性的检测手段, 且临床发生率不低, 对PCI术后患者预后影响大，已经引起了临床的重视[7]。近年来，国内外专家对基因多态性与氯吡咯雷低反应的相关性存在争议，对CYP2C19基因型的检测意义存在质疑[8，9]。氯吡格雷是一种前体药物需经过肝P450系列酶(CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19等编码)两步氧化反应转化为有活性的代谢产物,而CYP2C19基因编码的酶蛋白参与上述两步氧化反应，是影响氯批格雷代谢活化的关键酶。研究发现该基因有两个主要的功能缺失型等位基因 CYP2C19*2(681G>A)和 CYP2C19*3(636G>A)，分别是第 5 外显子的碱基缺失、第 4 外显子的碱基突变，产生了1个终止密码子，导致蛋白合成被提前终止，使得氯吡格雷的活性代谢产物减少，降低了氯吡格雷抗血小板作用[9]。本研究中氯吡格雷低反应的发生率为39.5%，与相关研究报道的氯吡格雷抵抗在不同人群的发生率4%～44%相符[10]。研究发现等位基因出现的频率因种族不同而异,功能缺失*2和*3是东方人群中 2 个主要的有意义的基因突变,突变频率18%～23%[11]。携带该两个等位基因中的任何一个将被认为是慢代谢者[12]。

本研究中携带CYP2C19*1/*1与CYP2C19*1/*2(46.28±26.67vs38.58±21.99)，CYP2C19*1/*1与 CYP2C19*2/*2(46.28±26.67vs33.18±25.01)，差异有统计学意义，P<0.05。快代谢型与中间代谢型(46.28±26.67vs38.32±21.47)差异有统计学意义(P<0.05)。本研究结果显示，CYP2C19*2影响氯吡格雷抗血小板效果，与CLOVIS-2试验[13]、ELEVATE-TIMI56[14]研究一致。CLOVIS-2研究中43例携带杂合子CYP2C19*1/*2和8例纯合子CYP2C19*2/*2患者代表CYP2C19 * 2的基因突变患者， 选择58例正常基因CYP2C19*1/*1患者作为对照，发现携带CYP2C19 * 2患者氯吡格雷的反应显著降低，显示呈基因-剂量效应。ELEVATE-TIMI56研究携带 CYP2C19*2杂合子稳定型冠心病患者服用3倍氯吡格雷225 mg/d的血小板抑制水平与非携带者75 mg/d一致，携带CYP2C19*2纯合子患者,即使给予300 mg/d的氯吡格雷，血小板抑制率亦无达标，进一步证实CYP2C19*2对氯吡格雷反应性的影响程度。本研究样本量少，携带CYP2C19*1/*3和CYP2C19*2/*3患者较少，两基因型组受氯吡格雷的影响小，组内血小板抑制率差异无统计学意义。本研究结果表明，携带中间代谢型患者的血小板抑制率较低，氯吡格雷低反应组血小板抑制率较低，中慢代谢型患者较多，均提示携带突变基因*2或*3影响体内氯吡格雷的活性代谢产物形成，导致抗血小板疗效降低，易出现氯吡格雷低反应。

综上所述，冠心病PCI术后患者氯吡格雷低反应与CYP2C19基因多态性相关，携带中慢代谢型基因者发生氯吡格雷低反应较多。考虑本研究两组射血分数、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白间的差异，且样本量较少，下一步还需进行大规模、前瞻性随机临床试验，继续对氯吡格雷低反应与CYPC19基因多态性做深入研究。

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(2015-02-10收稿 2015-03-23修回)

(责任编辑 郭 青)

Correlation between clopidogrel low response and CYP2C19 gene polymorphism in CAD patients after PCI

SUN Yaqin1，2, YANG Shengli2, and YANG Yong2.

1.Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003， China;2.Department of Cardiology,the General Hospital of Chiense People’s Armed Police Forces， 100039 Beijing, China

Objective To study the correlation between clopidogrel low respone and CYP2C19 gene polymorphism in coronary artery disease(CAD)patients after percutaneous coronary intervention(PCI). Methods A total of 200 patients with CAD admitted to this hospital from October 2013 to October 2014 were included in this study, and treated with dual antiplatelet drugs, aspirin and clopidogrel after PCI. The clopidogrel response was judged by depending on the ADP-induced platelet inhibition rate tested by thromboelastogram (TEG). In this study the ADP-induced platelet inhibition rate less than 30% was defined as clopidogrel low respone and the gene chip detection technology was used to detect the genotyes of CYP2C19 to further explore its effect on clopidogrel respone. Results In these 200 patients, the ADP-induced platelet inhibition rate was statistically significantly different between patients carrying CYP2C19*1/*1 and CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*1 and CYP2C19*2/*2、extensive and intermediate metabolizers. The total occurrence of clopidogrel low response was 39.5%(79 patients) . There was significant difference between clopidogrel low respone and CYP2C19 genotyes、 metabolizers， indicating that more carriers with extensive metabolizer (CYP2C19*1/*1) in the clopidogrel response group(P=0.013)， more carriers with intermediate or poor metabolizers in the clopidogrel low response group(P=0.013). Conclusions There is correlation between clopidogrel low respone and CYP2C19 gene polymorphism in patients with CAD after PCI, more carriers with intermediate or poor metabolizers in the clopidogrel low response group.

CYP2C19 gene polymorphism；the ADP-induced platelet inhibition rate； coronary artery disease

孙亚勤，硕士，E-mail:18701239125@163.com

1.453003，新乡医学院;2.100039 北京，武警总医院心内科

杨胜利，E-mail:yangshengli@medmail.com.cn

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