适体及其在分析检测中的应用*

富波，范卓文

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

适体(aptamer)是经过指数富集配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)筛选出来的能够特异性结合蛋白质或其它小分子物质的寡核苷酸片段。指数富集配体系统进化是由Szostak和Goldberg两个研究小组在1990年分别独立地提出的一种体外筛选技术［1-2］，该技术是从一个人工构建的、巨大的单链寡核苷酸文库中筛选出与目标物高选择性、高亲和力结合的DNA或者RNA片段，这样的片段被称为核酸适体，简称适体。

1 适体筛选过程及特点

1.1 适体的指数富集配体系统进化筛选过程

(1)通过化学合成法构建一个巨大的、序列随机的单链寡核苷酸文库；(2)在特定的缓冲溶液体系和温度下，将这些随机序列与目标物进行孵育，结果只有极少数随机序列与目标物结合；(3)通过物理的方法分离出结合物，并将随机序列和目标物分离；(4)将分离出的随机序列进行RT-PCR扩增；(5)扩增产物再与目标物一起孵育，进入下一轮筛选。如此，经过多轮筛选，就能够得到与目标物高选择性、高亲和力结合的适体。

1.2 适体的特点

与传统的识别元素抗体相比，适体作为一种新型的识别元素具有很多独特的特点：(1)适体与目标物结合具有高选择性和高亲和力。亲和力高是因为适体是经过多轮筛选而得到的，在筛选的过程中适体和目标物的解离常数不断地降低。适体还具有高选择性，可以区分目标物结构的微小差异，例如，茶碱与咖啡因结构只相差一个甲基，与可可碱相比只是甲基位置不同，而茶碱适体却能特异识别茶碱，与其它两种物质无反应［3］；L-精氨酸的适体与L-精氨酸的亲和力比与D-精氨酸高出12 000倍［4］。(2)适体能够结合的目标物十分广泛：适体不仅可以和酶、生长因子、抗体等较大的蛋白质分子结合，还可以和金属离子、有机染料、氨基酸、核苷酸、肽、药物等小分子结合，甚至可以与完整的细菌、病毒和细胞结合［5］。(3)适体经过体外筛选、化学合成而得，相比抗体而言，其生产效率高、成本低，纯度高、组成确定。(4)适体的稳定性好，冻成干粉后可以在室温条件下保存数年，适当溶解后又立刻恢复其功能，并且可以反复变性、复性，重复利用。

2 适体在分析检测中的主要应用

2.1 农药检测

农药是一类小分子化合物，在农业生产中占有重要的地位。目前农药残留定性和定量分析的主要方法有各种经典色谱法、光谱法等，还有酶抑制法和酶联免疫分析方法。近年来，随着适体及其筛选技术的发展，能够识别农药的适体也被筛选出来，并用于农药的检测。王丽等［6］采用新的指数富集配体系统进化筛选策略筛选出了甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果4种有机磷农药的适体，并对其结构进行了分析，这为建立基于适体识别的农药分析检测方法奠定了基础。啶虫脒、马拉松以及杂环聚环芳香烃类农药也已经通过基于适体识别的方法被检测出来［7］。目前基于适体识别的农药检测还都处于初级阶段，未来的发展趋势是筛选出更多与各种农药分子高特异性、高亲和力结合的适体，结合光化学，电化学等检测手段，建立更多的基于适体识别的农药分析检测方法。

2.2 药物检测

药物是人类防病、治病必不可少的武器，目前药物的分析方法日新月异。除了传统的分析方法，适体在药物的分析检测中也得到了广泛的应用。目前已经有许多应用适体识别的方法对小分子药物进行检测的报道，例如Teramae课题组和Xiang课题组均利用DNA双链空白位点结合染料和腺苷适体建立了腺苷的分析检测方法［8-9］，检测限分别达2 μmol／L和6 μmol／L。虽然对腺苷的检测灵敏度不及一些电化学检测方法高，但是已经优于一般的光学检测方法，重要的是此类方法简单、快速、无需荧光标记。Dong课题组利用银纳米簇作为荧光信号，建立了基于适体识别的、通用的可卡因和三磷酸腺苷的分析检测方法［10］。在该方法中，适体被分为两个片段，每个片段都连接一段富含G碱基的DNA序列。没有目标分析物的时候，两个适体片段处于游离状态，生成的银纳米簇发出微弱的荧光；加入目标分析物时，两个适体片段与目标分析物结合，使得两个富含G碱基的DNA序列靠近，此时生成的银纳米簇荧光强度显著增强。此方法对可卡因和三磷酸腺苷的检测限分别达0.1 μmol／L和0.2 μmol／L。该课题组还利用铜纳米粒子作为荧光信号、适体作为识别分子，建立了基于新的检测原理的分析检测方法，实现了对三磷酸腺苷的检测，检测限低至28 nmol／L［11］。基于适体自组装的原理，茶碱的分析检测方法也被建立起来［12］。

另外，多种抗生素适体也被筛选出，包括土霉素、新霉素B、四环素、氯霉素、托普霉素、卡那霉素A和B、妥布霉素、链霉素、莫诺霉素、环孢霉素A、青霉素类抗生素、蒽环类抗生素等［13-14］。相应的分析检测方法也被建立起来，例如Song等［15］应用纳米金材料建立了卡那霉素的比色适体传感器，检测限为25 nmol／L；范婷等［16］建立了青霉素类抗生素的电化学适体传感器，检测限达2.81 nmol／L。这些药物的适体多为RNA序列，与DNA适体相比较，RNA适体的保存和使用条件较高，很容易被酶解，因此限制了此类适体在分析检测方面的应用。

2.3 金属离子检测

金属离子的检测在临床检验、环境监测等方面都有重要的作用。金属离子适体的出现也为金属离子的检测开辟了新的途径。基于适体识别的K+的分析检测方法已多有报道。K+的检测方法多借助凝血酶适体来构建，凝血酶适体能够折叠成G-四分体，由于G-四分体是一系列鸟嘌呤依靠氢键和离子之间的相互作用来稳定，因此适体的折叠程度与K+的浓度密切相关。Nagatoishi等基于荧光能量共振转移的原理，设计了K+的荧光检测方法［17］。Shi等建立了基于分子信标的K+荧光检测方法［18］。高淑丽等［19］利用适体和双链DNA内插染料噻唑橙建立起K+的荧光检测方法。在该方法中，适体先与它的互补链形成双链，噻唑橙分子插入双链结构，发出强烈荧光；加入K+后，与适体结合形成G-四分体结构，使双链解离变成G-四分体结构和单链，从而噻唑橙分子游离出来，荧光强度大大降低。该方法可以实现对青霉素V甲片中K+的检测，其结果与原子吸收法一致。此外，一些能够和重金属离子以及放射性离子特异性结合的适体也被筛选出来，并建立了相应的分析检测方法，例如Pb2+，Hg2+，UO22+等［20-24］，这为有毒害金属离子的环境监测提供了新的思路。

2.4 微生物检测

适体能够结合的目标物非常广泛，微生物也可以筛选得到相应的适体，并建立相应的分析检测方法，有望应用于临床检验和食品微生物检验。文晓堂［25］和王一娴［26］等分别对适体在微生物检测方面的研究进展进行了综述。特别是与量子点、碳纳米管等新型纳米材料相结合时，基于适体识别的检测方法的灵敏度和效率都得到提高。目前已经建立了基于适体识别的拉热弗朗西斯菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏杆菌、大肠埃希菌等微生物的分析检测方法［27-31］。

2.5 蛋白质检测

蛋白质是适体主要的目标物之一，因为蛋白质相对分子质量比较大，有复杂的立体结构，因此筛选出来的相应适体也具有更高的选择性和更高的亲和力。至今，已经筛选出来数百种蛋白质的适体，其中包括细胞因子、酶、抗体等。这些蛋白质一般与生命的正常活动和疾病的发生有密切的联系，这些蛋白质的检测对于临床检验和疾病的发现、治疗都具有重要的意义。因此基于适体识别的各种蛋白质分析方法也迅速发展，并且与多种检测手段相结合，例如荧光法、比色法、电化学方法等［32-38］。其中以凝血酶作为模板目标物，基于适体识别的蛋白质检测方法被大量报道［39-41］。另外，基于适体识别的血小板生长因子、免疫球蛋白、溶酶体等蛋白质的分析检测方法也被建立［42-46］。近年来，新型纳米材料的出现也为基于适体识别的蛋白质分析检测方法提供了新的思路。Li等［47］应用银纳米簇建立了凝血酶的适体识别分析检测方法，检测限为5 nmol／L。Liu等［48］构建了基于石墨烯的分析检测平台，采用适体作为识别元素，不仅可以检测蛋白质，还可以检测小分子和DNA片段。为了不断提高蛋白质的检测灵敏度，DNA扩增技术被引用到了基于适体识别的分析检测方法之中。Zhang等［49］建立了基于适体识别、链取代扩增和指数扩增的血小板生长因子的分析检测方法，检测限低至0.9 pmol／L。Wang等［50］建立了血小板生长因子的支链滚换扩增的检测方法，检测限低至1.6 fmol／L。

2.6 生物毒素检测

适体还在生物毒素的分析检测中得到应用。Gruz-Aguado等筛选得到赭曲霉素A的适体并初步应用于其分析检测［51］。随后，荧光、比色、电化学的和酶联免疫的适体分析检测赭曲霉素方法也都被建立起来［52-55］，检测限最低可达0.07 ng／mL。黄曲霉素和微囊藻毒素的适体分析检测方法被建立并应用于样品检测［56-57］。

3 结论

经过20多年的发展，适体筛选技术得到不断改进和完善，目标物范围不断拓展。适体作为一种理想的识别分子，在分析检测方面得到了快速发展。但适体技术在分析检测方面仍然存着一定问题和局限性，例如检测灵敏度和分析效率有待提高。近年来，新型纳米材料，例如纳米金、碳纳米管和石墨烯等，不断与基于适体识别的分析检测方法相结合，使这些方法得以改善。另外，适体的本质是核酸，这使适体能够很好地与核酸扩增技术相结合，这对基于适体识别的分析检测方法灵敏度的提高有重要意义。随着筛选技术的发展、新型适体的研究和制备、适体与新型纳米材料以及核酸扩增技术的结合，适体必能在分析检测以及更多的领域展现更高的活力和应用价值。

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