猪链球菌毒力因子致病机制研究进展

吴静波，南文金，胡鸿惠

（1.韶关学院英东生命科学学院，广东韶关512005；2.韶关学院英东动物疫病实验室，广东韶关512005）

猪链球菌（Streptococcussuis，SS）是给全球养猪业带来严重经济损失的主要病原之一，也是一种人兽共患病病原，它能够引发多种疾病，包括菌血症、败血症、脑膜炎和心内膜炎等，严重时可致休克性死亡。根据荚膜抗原的差异将猪链球菌分为35个血清型（1-34，1／2），其中 SS1、SS2、SS1／2、SS7、SS9、SS14是主要的致病菌株，另外SS4、SS5、SS16和SS24也出现过人感染的病例［1］。目前欧洲、美洲、亚洲、澳大利亚和新西兰均有人感染病例的报道，在大部分地区感染者一般为职业暴露人群，但在东亚和东南亚，SS也能感染一般人群，严重威胁公共卫生安全；在越南、泰国和香港，SS感染是成人脑膜炎的主要病因。而在中国，1998年和2005年则分别暴发了两次致命的人群感染SS事件，造成240多人感染和52人死亡［2］。

SS感染后一般定植于机体黏膜上皮细胞，部分菌株不引起临床症状，或者只导致轻微的菌血症或败血症，但另外一些毒株可突破上皮屏障进入血液循环系统，侵入脑、心、肺等主要器官中，引发大量的炎症反应。出现这种毒力差异是因为不同类型和不同地区的SS菌株携带有不同的毒力因子［3］。毒力因子一直是SS研究的热点，近年来，研究者应用基因操作技术对SS的毒力因子进行筛选，分析了近60个菌株，推测出约61个毒力相关因子。并根据各自特征及功能，将毒力因子分为4组，分别为表面／分泌因子类、酶／蛋白酶类、转录和调节因子、其他［1］。研究指出这些毒力因子均直接或间接影响菌株的致病性，但各毒力因子对菌株毒力的影响及对机体的具体作用机制仍不明确，严重阻碍了SS致病机制的研究［1］。现阶段研究主要限于细菌引发脑膜炎的机制，具体的致病机制仍不清楚，更是缺少细菌毒力因子与致病机制相关性的研究。本文主要简述目前有关SS感染发病机制的研究进展，并重点介绍各个阶段中相关毒力因子所起的作用，初步阐明毒力因子与发病机制的相关性。

1 SS定植过程

定植是SS感染的第一步，而黏附和入侵黏膜上皮细胞则是SS成功定植的先决条件。在动物中，SS能够在扁桃体中长久生存的具体机制仍不清楚，但扁桃体中的淋巴组织被黏膜上皮覆盖，隔断了细菌和免疫系统之间的直接接触，为SS的长久定植提供了一个较为稳定的环境；这一优势在猪体上更为明显，猪的黏膜上皮细胞深嵌入淋巴结组织中，形成众多的分支隐窝，极大的增加了细菌的接触面积，更有利于SS黏附和入侵黏膜上皮细胞［4］。

1.1 黏附过程

SS黏附过程一般是菌体表面蛋白分子与细胞外基质（ECM）相互反应的过程，ECM包括纤粘连蛋白、纤维蛋白溶酶原和胶原等。大部分菌体表面或分泌型的毒力因子均参与了细菌的黏附，包括纤粘连蛋白结合蛋白（Fbps）、烯醇酶（Eno）、双肽酰肽酶IV（Dpp IV）、分选酶 A（SrtA）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、热休克蛋白J（DnaJ）、表面黏附素（Ssa）等，其中Fbps、Eno、Dpp IV、GAPDH、DnaJ、Ssa都可直接与 ECM 反应，起毒力因子作用；而MRP需要经SrtA加工后锚定于细胞壁肽聚糖上后才能与ECM结合［4-7］。研究显示除Fbps外上述毒力因子的缺失株均能明显降低SS的黏附能力，但不能完全阻断细菌黏附，即SS黏附是由细胞壁上多个组成共同参与的，缺少其中一个或多个都不能完全阻断细菌黏附［4，6，7］。另外，毒力因子荚膜蛋白（CPS）阻碍了表面蛋白与ECM的结合，是SS黏附作用的负调节子，抑制其黏附和侵入上皮细胞，但也有研究显示CPS中的多种成分有助于细菌黏附，尤其是其中的唾液酸成分［5］。

1.2 入侵过程

入侵黏膜上皮细胞不是SS成功定植的必要条件，但有利于细菌生存，并且可能是SS在体内扩撒和发病的首要步骤。毒力因子溶血素（Sly）是一种胆固醇结合类细胞毒素，在SS侵入和裂解细胞的过程中发挥重要作用，可破坏微血管内皮细胞、上皮细胞和巨噬细胞，有利于细菌在组织内扩散［5，8，9］。不过并非所有SS都含有Sly基因，其流行存在一定地域性，北美分离株的溶血素阳性率明显低于欧洲、亚洲分离株；另外部分Sly基因敲除菌株也能出现在血液中，并且毒力与亲本株相似［5］。因此，不能单纯以Sly作为区别猪链球菌毒力强弱的标准。

SIgA介导的黏膜免疫系统在抵御SS入侵中扮演着重要角色，而毒力因子IgA蛋白酶（Iga1protease）能够减少免疫效应IgA的含量，降低机体的防御能力；降解释放的Fab片段还能提高菌体表面疏水性，以增强细菌的黏附能力并阻止完整IgA接触菌体［4］。研究显示Iga1protease缺失后，缺失株抵抗吞噬细胞的能力和对Hep-2细胞的黏附能力明显下降；猪的攻毒试验显示亲本株和缺失株的致病率分别为100%和22%，存在差异，同时缺失株组血液中的带菌量和致死率也明显下降，表明Iga1protease与SS的黏附和侵入密切相关［10］。

2 SS传播过程

SS必须突破黏膜上皮细胞才能进入血液或组织中引发疾病，目前SS突破的位置仍不明确，比较认可的位置是上呼吸道内的黏膜上皮细胞［1］。SS突破黏膜上皮细胞到达深层组织或血液中，就有被巨噬细胞吞噬的可能。但在缺乏特异性抗体的条件下，SS可抵御巨噬细胞的吞噬，导致血液中菌体浓度不断升高，引起菌血症和炎症反应。SS抵御巨噬细胞吞噬主要依靠CPS；研究显示CPS能够使SS免受中性粒细胞与单核巨噬细胞的吞噬和杀伤［11］。进一步研究显示CPS的这种抗吞噬作用主要依靠其丰富的唾液酸（SA）成分，SA是许多细菌的抗吞噬因子，能够黏附于巨噬细胞上，弱化巨噬细胞吞噬作用［12-13］。

当然SS的抗吞噬作用不单靠CPS，研究显示毒力因子肽聚糖葡糖胺脱乙酰酶（PgdA）也有助于SS抵抗吞噬细胞吞噬；敲除PgdA后，抵抗中性粒细胞吞噬的能力明显下降，攻毒试验也显示缺失株的毒力远远弱于亲本株。进一步研究显示SS与中性粒细胞相互作用后能够上调PgdA的表达，促进肽聚糖的脱乙酰化，以抵御中性粒细胞介导的细胞杀伤作用。相似的毒力作用还表现在毒力因子磷壁酸D-丙氨酰化酶（DltA）上［14］。

另外，SS在传播的过程中需要摄取宿主体内的微量元素，以维持细菌的正常生长代谢［15］。SS的微量元素吸收调控蛋白（AdcR，PerR，mtsR）［16-18］、转运蛋白（Fhu，FeoB，Mut，Mts）［18］和结合脂蛋白（TroA）［19］等组成的金属微量元素吸收和转运系统，保证了细菌在扩散过程中获得生长必须的营养成分，对SS持续感染有着至关重要的作用，缺失任何一个都能造成血液中菌体浓度的下降。不过这些毒力因子是否与SS的致病机制有关，仍需要进一步试验证实。

3 炎症反应和感染性休克过程

SS感染后能够激活机体免疫系统以抵御细菌感染，但是过度的免疫应答却能引发严重的炎症反应，甚至是感染性休克。研究发现部分SS感染宿主能诱导过量促炎症因子的释放，包括TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-γ和趋化因子CCL2／MCP-1、CCL3、CCL5／RANTES、CXCL1／KC、CXCL8等，激活NF-кB通路，破坏机体免疫平衡状态，引发严重的炎症反应［20-24］。推测这可能是SS感染早期引起宿主急性死亡的原因，另外大量促炎症因子的产生能够增加血脑屏障的通透性，帮助SS进入中枢神经系统，引发脑膜炎［22］。

大量试验表明，SS的细胞壁成分在诱导促炎症因子释放的过程中发挥着重要作用；Tanabe S等［20］发现全细胞壁成分在体外刺激人巨噬细胞可诱导大量IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的产生，并且人血红素能够明显增强该诱导作用。对细胞壁成分的进一步研究显示，CPS能够与宿主TLR-2作用诱导巨噬细胞和树突状细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8，并特异性诱导趋化因子MCP-1和CCL3的产生［20-23］；脂蛋白（Lgt）与 TLR-2／6复合体作用能够诱导IL-1β、IL-8的产生，并激活转录因子 NF-кB［24］；Sly与 TLR-4结合能够激活巨噬细胞，诱导TNF-α和IL-6的释放，并激活转录因子 NF-кB［8］；枯草杆菌素样蛋白酶（SspA）能够诱导巨噬细胞产生IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL8和 CCL5［26］。

4 突破血脑屏障过程

动物试验显示，宿主感染SS后早期主要表现为关节炎，跛行，蜷伏等，然后发展为败血症性休克，如果感染宿主没有因败血症和中毒性休克死亡，细菌则容易进入神经系统（CNS）引起脑膜炎［22］，大约69.5%的病人可发展为脑膜炎［2］。与其他血源性病原相似，SS要成功侵入CNS必须经过血脑屏障（BBB）。构成BBB的主要细胞为脑微血管内皮细胞（BMEC），体外试验表明单纯的SS能够黏附于BMEC上但不能直接侵入BMEC；在这之前研究者推测SS突破BBB可能存在以下两种机理。一是“特洛伊木马”理论［5］，SS黏附于巨噬细胞上，或者被吞噬细胞吞噬，在巨噬细胞突破血脑屏障后释放细菌；二是跨细胞途径，SS诱导BMEC产生IL-6、IL-8和MCP-1等促炎症因子，能够使细胞的通透性增加，甚至破裂；有助于细菌侵入细胞穿过屏障［22］。所以，与细胞黏附和促炎症因子释放有关的毒力因子都与SS突破血脑屏障过程紧密相关。

不过，最近有研究者提出第3个突破途径，即细胞旁路途径，认为SS通过BMEC之间的细胞间隙穿过BBB。BBB的关键结构是细胞间的紧密连接，紧密连接由Claudin、Occludin和连接黏附分子JAM组成，在维持细胞极性、细胞通透性及内环境稳定性方面起重要作用。而研究显示SS的细胞壁成分SSU05-1000蛋白和SSU05-0272蛋白分别与BMEC作用后均能够引起Claudin-5表达量下降，破坏细胞间的紧密连接，导致通透性升高，从而有助于SS通过细胞旁路途径进入CNS［26-27］。

5 结语

不可否认，毒力因子与细菌的致病机制息息相关。但目前对猪链球菌毒力的定义还比较模糊，大部分研究者将从患病宿主中分离的菌株定义为有毒力株，从健康宿主分离的菌株定义为无毒力株，缺少统一的标准。不同的研究团队对毒力的观念、研究方向和方法都存在差异，并且使用菌株和试验动物也存在差别。这就造成了部分毒力因子只针对于特定的菌株或动物中，或者同一毒力因子在不同菌株或动物中致病力不同；另外利用基因敲除和突变技术进行研究，可能只是影响SS的生长代谢而造成毒力降低或消失的假象［28］，由此鉴定出的基因元件可能并不是SS的毒力因子或者与SS致病机制无关。所以虽然近年来研究推测出的毒力因子很多，但能明确的毒力相关因子却寥寥无几，并且目前并没有发现可明确区分强毒株，弱毒株，无毒株的标志性毒力因子，毒力的确定困难重重，极大影响了SS致病机制的研究。本文对SS感染宿主和致病的每一个阶段都进行了全面的论述，深入分析了各个阶段中相关毒力因子所发挥的作用，将SS的毒力因子与其致病机制相结合进行探讨，阐明了毒力因子与致病机制之间紧密的相关性，为深入研究SS的具体致病机制提供参考。

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