PRRSV抑制Ⅰ型IFN信号通路研究进展

闫晓霞，谢丽君，刘欢欢，高　洪，杨进成，严玉霖＊（.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明6500；.云南省大理州南涧县畜牧站，云南南涧675700）

PRRSV抑制Ⅰ型IFN信号通路研究进展

闫晓霞1，谢丽君1，刘欢欢1，高洪1，杨进成2，严玉霖1＊
（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.云南省大理州南涧县畜牧站，云南南涧675700）

摘 要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪的一种病毒性传染病，给全球的养猪业带来了巨大的经济损失。Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）是主要的抗病毒细胞因子，被认为是先天性免疫和适应性免疫之间的桥梁。PRRSV可以通过其编码蛋白来抑制干扰素的产生和阻碍干扰素激活的抗病毒信号通路，从而造成PRRSV在猪体内持续性感染。论文主要对PRRSV基因组、干扰素产生的信号通路和PRRSV抑制干扰素产生的机理进行综述。通过了解PRRSV和机体天然免疫应答之间的关系，以期为深入认识PRRSV的致病机理，并为PRRSV的疫苗研制提供理论基础。

关键词：PRRSV；干扰素；抑制机制

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起猪的一种病毒性传染病。该病以怀孕母猪流产、早产、死胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪呼吸道症状，高病死率为主要特征［1-2］。该病于1987年最早发现于美国，随后在各国蔓延。根据基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型（LV株为代表株）和美洲型（ATCC-VR2332株为代表株）。PRRSV可以通过抑制干扰素（interferon，IFN）的产生来逃避机体的天然免疫，使感染猪产生严重的免疫抑制，抵抗力降低并导致多种并发症，给养猪业带来严重的经济损失。Ⅰ型IFN特别是IFN-α和IFN-β在机体抗病毒天然免疫中发挥着重要作用，其功能主要是抗病毒作用，控制病毒复制，保护细胞抵抗感染。

1　PRRSV的基因组特性

PRRSV的基因组为不分节段的单股正链RNA，全长约为15kb，至少具有10个开放阅读框（open reading frame，ORF），即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7和2011年发现的ORF5a基因［3-4］，每两个相邻的读码框之间都有部分的核苷酸序列重叠。ORF1a和ORF1b位于基因组的5′端，约占基因组全长的3/4，编码Nsp1α、Nsp1β、Nsp2、Nsp2TF和Nsp3-Nsp12共14个非结构蛋白（non-structural proteins，Nsp）［5］。近年来研究表明Nsp1α、Nsp1β、Nsp2、Nsp4和Nsp11能以不同的强度抑制IFN-β启动子，说明PRRSV Nsp能够通过削弱Ⅰ型IFN反应来破坏机体的天然免疫反应［6］。Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，在病毒RNA合成方面具有重要作用［7］。Nsp10具有解旋酶活性，对病毒的复制与转录具有调控作用［8-9］。然而Nsp6，Nsp8和Nspl2的功能目前还不是很清楚。

ORF2a、ORF2b、ORF3-4、ORF5、ORF5a和ORF6-7位于PRRSV基因组3'端，编码8个病毒结构蛋白，依次分别为糖蛋白2a（GP2a）、小包膜蛋白（E或GP2b）、GP3、GP4、GP5、GP5a，膜蛋白（membrane protein，M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。GP5 和M蛋白是病毒的主要结构蛋白，二者可以通过二硫键的作用形成二聚体，介导病毒和猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM）表面的肝素受体结合而感染细胞［10］。GP2a和GP4与PAM上的PRRSV受体CD163（cluster of differentiation 163）能够相互作用［11］。在马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）研究中表明，E蛋白与病毒的感染性有关［12］。GP3具有很好的抗原性［13］。

2　Ⅰ型干扰素的信号转导途径

干扰素特别是Ⅰ型IFN是机体抵抗病毒感染的一种重要细胞因子，可以通过抑制病毒的复制和刺激先天性免疫和适应性免疫来限制病毒感染邻近未感染的细胞。宿主细胞通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别病毒进化中保守的抗原分子——病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），激活的PRR将信号分子传递给其配体分子髓样分化因子88 （myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）、诱导IFN-βTIR结域接合蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β，TRIF）、白介素-1受体相关激酶（interleukin-1receptor-associated kinase，IRAK）和干扰素启动子刺激因子1 （IFN promoter stimulator 1，IPS-1），配体活化后作为信使激活信号途径下游IкB激酶复合体α/β/γ （IκB kinaseα/β/γ，IKKα/β/γ），丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和TANK结合激酶1（TRAF family member-associated NF-кB activator（TANK）binding kinase 1，TBK1），进而激活核转录因子кB（nuclear factorkappa B，NF-кB）、激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）和干扰素调节因子3（Interferon regulation factor 3，IRF3）［14-15］。活化的转录因子进入细胞核诱导Ⅰ型IFN产生和炎性细胞因子的表达，使邻近未受感染的细胞处于抗病毒的状态，同时作为关键的调节物引起机体的适应性免疫应答。PRR中，Toll样受体（Toll like receptor，TLR）和视黄酸诱导基因-Ⅰ样受体（retinoic acid-induced geneⅠ-like receptors，RLRs）对Ⅰ型干扰素的产生尤为重要。

干扰素的产生主要有4条信号传导途径［16］：TLR3依赖性信号转导，TLR4依赖性信号转导，TLR7、9依赖性信号转导，视黄酸诱导基因-Ⅰ（retinoic acid induced geneⅠ，RIG-Ⅰ）和黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation associated gene 5，MDA5）依赖性信号转导。第一阶段IFN产生后，机体免疫反应进入第二阶段，大量干扰素诱导的相关基因（IFN-stimulated genes，ISGs）的表达。IFN表达后，细胞以自分泌或旁分泌的方式将IFN分泌到细胞外并与膜上的IFN受体（IFN receptor，IFNR）结合，激活Janus激酶-信号转导与转录激活子（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）信号通路。受体结合激活JAK1和激酶Tyk2后招募STAT1和STAT2分子，并使其磷酸化形成STAT1-STAT2二聚体，随后和IFNR分离，与IRF9结合形成被称作干扰素刺激基因3（IFN-stimulated gene 3，ISGF3）的STAT1-STAT2-IRF9复合体，然后ISGF3入核与共有DNA序列结合启动ISG表达，使细胞处于抗病毒状态［17-18］。一旦ISGF3入核之后，STAT1/2去磷酸化，离开细胞核回到细胞质中。

3　PRRSV抑制干扰素产生的机理

PRRSV感染猪以后导致中和抗体的延迟产生和微弱的细胞介导的免疫应答，其原因是PRRSV抑制了干扰素介导的先天性免疫应答。能够抑制干扰素产生的PRRSV蛋白有Nsp1、Nsp2、Nsp11、N等蛋白，它们可以通过不同的途径来抑制IFN的产生。Nsp1（Nsp1α和Nsp1β）通过抑制IRF3的磷酸化和核转移，促使CBP的降解，下调IRF3和抑制IRF3的磷酸化；Nsp1β通过降解核转运蛋白α1 （karyopherin-alpha1，KPNA1）来阻断STAT/ STAT2的核转移；Nsp2通过阻断IRF3的磷酸化和核转移，干扰IκB的磷酸化并阻止它的降解，抑制ISG15的产生；Nsp11主要抑制IRF3的磷酸化和核转移以及抑制IPS-1的活性；N通过阻断IRF3的磷酸化和核转移，阻断STAT1/STAT2的核转移；GP5主要抑制IRF3的磷酸化。

3.1抑制IPS-1活性

IPS-1也称为病毒诱导的信号转导蛋白（virus-induced signaling adapter，VISA）或线粒体抗病毒信号（mitochondrial antiviral signaling，MAVS）是RLR信号通路中的一个重要接头蛋白［19］。RIG-1和MDA-5识别病毒双链RNA后通过其细胞调亡蛋白招募结构域样基序（caspase recruitment domain，CARD）结构域与接头蛋白IPS-1的CARD结合。RIG-1和IPS-1之间的CARD-CARD相互作用对于双链RNA诱导的NF-κB、IRF3和IRF7的激活是必不可少的。激活的IPS-1通过肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF-receptor-associated factor，TRAF）结合位点与TRAF2和TRAF6结合，激活IKKα/β/γ复合体，进而激活NF-κB信号通路。同时，活化的IPS-1还可以与TRAF-3结合，招募并激活TBK-1和诱导IκB激酶（inducible IκB kinase，IKKε），激活的TBK-1和IKKε使IRF-3和IRF7发生磷酸化并活化，然后IRF-3/IRF-7以二聚体的形式进入细胞核，诱导IFN-α/β的表达［20］。PRRSV的Nsp11含有一个NendoU结构域，用一系列的NendoU突变体来研究IPS-1的降解与NendoU活性之间的关系，结果表明Nsp11的内切酶活性与IPS-1mRNA的降解有关［21］。Nsp11抑制了IPS-1的活性，阻碍了下游信号传导，进而抑制了IRF-3和NF-

κB的活性，阻碍了IFN-β的产生。荧光素酶报告基因的试验结果表明NSP1α和NSP1β也能够抑制IPS-1的活性。

3.2调节IRF3活性

TLR3识别病毒后通过一系列的级联信号传导激活了IRF3。IRF3是诱导干扰素产生的一个关键的转录因子。通常IRF3以未激活的状态存在于细胞质中，当受到刺激后IRF3发生磷酸化并转移到细胞核，招募CREB结合蛋白（CREB-binding protein，CBP）/p300形成增强子启动IFN-β基因表达。因此，许多病毒通过调节CBP来抑制干扰素的产生，逃避机体的天然免疫。PRRSV感染初期能促进IRF3磷酸化而激活IFN-β启动子，但随着感染继续，IFN-β启动子的活性很快被抑制，显著阻止IFN-β的合成。PRRSV Nsp1可以促进核内CBP的降解，进而抑制IRF3活性，阻止IFN-β的生成。Nsp2是个膜锚定蛋白，含有半胱氨酸蛋白酶（CP）活力和一种解离活力，CP活力可以抑制IRF3磷酸化和核移位从而抑制IFN-β的表达。结构蛋白N和Nsp11也可以抑制IRF3的磷酸化和核转移［22］。研究发现GP5蛋白可以抑制IRF-3的磷酸化［23］。

3.3调节NF-κB活性

NF-кB信号通路是机体对抗病毒做出的保护性应答，NF-кB在先天性抗病毒应答中有着重要的作用，所以病毒往往通过阻止NF-кB的激活来逃避宿主免疫。研究发现在PRRSV感染后36h～48hNF-кB会上调。PRRSV N蛋白能显著激活NF-кB［24］。相反Nsp1α能够抑制IкB的磷酸化，使其不能脱离NF-кB，阻碍NF-кB进入细胞核［25］，此外NF-кB活化抑制还与IFN-β生成量少相关。Nsp2可能通过它的卵巢肿瘤（ovarian tumor，OUT）区干扰IκB多聚泛素化，从而阻止IкB降解，抑制NF-кB激活。但是也有研究表明，在MARC-145细胞和Hela细胞中Nsp2能够诱导的降解以及NF-кB的p65亚基发生磷酸化和转核，且呈剂量依赖性［26］。

3.4抑制JAK-STAT和ISG

PRRSV抑制Ⅰ型IFN的信号不仅在IFN的产生期，还可以抑制IFN激活的信号通路。在Mark-145 和PAM细胞上，PRRSV可以抑制干扰素激活的JAK/STAT信号转导和ISG的表达。PRRSV感染的细胞中，IFN诱导的STAT 1和STAT 2磷酸化及其异源二聚体的形成都未受影响，但大部分的ISGF3仍存在于PRRSV感染细胞的细胞质中，这表明是三聚体ISGF3的核移位受到了阻碍［12］，进而阻碍了干扰素的产生。抑制IFN激活的信号通路的PRRSV蛋白有Nsp1β、Nsp7、Nsp12、GP3和N［27］。Nsp1β的N端含有降解KPNA1的泛素样蛋白酶［28］，而KPNA1的作用是和ISGF3结合使其从细胞质进入细胞核发挥作用。研究发现不同的PRRSV分离株对KPNA1的表达存在差异，其原因是19位点的氨基酸不同。N蛋白可以通过抑制STAT 1的核转移来阻碍IFN的激活。ISG15是个泛素样抗病毒蛋白，因为泛素化参与了先天性免疫的信号通路，所以由ISG15介导的ISG化被认为有调节干扰素的功能。PRRSV Nsp2可以通过OTU结构域的去泛素样活力来抑制ISG15的干扰素调节功能［29-30］。

4　小结

PRRSV可以通过多种途径来抑制机体的先天性和适应性免疫应答。干扰素在免疫应答中发挥着关键的作用。PRRSV可以通过多种调节机制来抑制干扰素的产生，如抑制IRF3的激活，促使CBP的降解，通过阻断ISGF3的核转移来抑制ISGs的表达。尽管对PRRSV调节机体免疫应答机制的研究取得了巨大的进步，但是不同的PRRSV分离株对IFN-α的敏感性是不同的，并且同一PRRSV株感染不同细胞后对IFN信号的干扰也存在差异，这给猪病的预防、诊断和控制造成更大困扰。因此，使用突变的PRRSV感染性克隆来消除PRRSV引起的免疫抑制，或者利用遗传育种技术通过改变宿主机体对PRRSV的敏感性可能是有效预防和控制PRRS的途径之一。

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Progress on Inhibition of Type I Interferon Signaling Pathway by PRRSV

YAN Xiao-xia1，XIE Li-jun1，LIU Huan-huan1，GAO Hong1，YANG Jing-cheng2，YAN Yu-lin1
（1.College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan，650201，China；（2.Nanjian Animal Husbandry Station，Dali State Yunnan Province，Nanjian，Yunnan，675700，China）

Abstract：Porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRS）is a viral disease caused by PRRSV，bringing great economic losses to swine herds worldwide.TypeⅠinterferon is principal antiviral cytokine，which is regarded as a bridge between the innate and adaptive immunity.PRRSV encodes proteins that can antagonize interferon production and impede IFN-activated antiviral signaling pathway，resulting in persistent infection in pigs.This paper summarized the genome of PRRSV，the signaling pathway of IFN production and the mechanisms in suppression of IFN by PRRSV.Thorough understanding the interaction between PRRSV and host innate immune response will help us know the pathogenesis of PRRSV and provide a theoretical basis for development of vaccine.

Key words：PRRSV；interferon；suppression mechanism

通讯作者

作者简介：闫晓霞（1990-），女，山西五台人，硕士研究生，主要从事畜禽传染病病理研究。＊

基金项目：国家自然科学基金项目（31160496，31360599）；云南省高校动物性食品安全与人兽共患病科技创新团队项目

收稿日期：2015-03-26

中图分类号：S852.659.6

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）09-0093-04