大理市下关镇动物源食品中四环素类抗生素残留的检测
2015-03-23卢跃红罗开敏王光婷吕荣聪孙慧媛熊发辉
卢跃红，罗开敏，王光婷，吕荣聪，孙慧媛，熊发辉
（1.大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003；2.大理学院公共卫生学院，云南大理 671000）
抗生素是一类有效防病治病的药物，广泛应用于现代集约化畜禽及水产养殖业中。在养殖生产的各个环节，抗生素往往通过口服、注射或作为饲料添加剂的方式被动物吸收利用。合理规范的使用抗生素，可以预防和治疗动物疾病〔1〕、调节动物生理机能、促进动物生长和繁殖、改善畜产品品质〔2-3〕。然而一些不法商家和养殖户为了获取更大的利益，在养殖生产中滥用各种抗生素〔4〕，抗生素不仅不能被动物完全吸收利用以原形代谢产物的形式排出体外，对环境造成污染〔5〕，间接地给人类健康带来威胁，而且造成畜产品中抗生素残留量超标〔6-8〕。人们长期摄入含抗生素残留的畜产品，会对人体健康造成很大的危害〔9-15〕。
四环素类抗生素因其广谱的抗菌效果和便宜的价格，成为近年来常用的兽药，品种主要有土霉素、四环素、金霉素等。本实验旨在对大理市下关镇市售新鲜猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉及其肝脏中四环素类抗生素残留情况进行测定，以期为该镇动物性食品的监测及消费者食用安全提供理论依据。
1 材料
1.1 试验材料在大理市下关镇不同的农贸市场、大型超市，随机采取市售新鲜猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉及其肝脏，每种样品来源不少于5 个农贸市场或大型超市，每份样品不少于100 g。共采样50份。
1.2 试剂土霉素（OTC，批号：130487-200703）、四环素（TC，批号：130306-200918）、金霉素（CTC，批号：130489-200202），均购自中国食品药品检定研究院，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
1.3 仪器高效液相色谱仪（Agilent1100，包括二元泵G4212B、自动进样器G1316C、柱温箱G4226A、二极管阵列检测器G4204A）；电子天平（AE240，瑞士梅特勒）；离心机；pH 计（pHS-25，上海雷磁仪器厂）；SK8200超声波清洗器（上海科导超声波仪器公司）。
2 方法
2.1 色谱条件色谱柱：ODS-C18（6.2 mm×150 mm，5 μm）、检测波长：355 nm、灵敏度：0.002 AUFS、柱温：25 ℃、流速：0.7 mL/min、进样量：10 μL、流动相：甲醇：0.01 mol/L 磷酸二氢钠溶液（20：80），用30%硝酸溶液调节pH 2.5，使用前超声脱气10 min。
2.2 标准溶液配制
2.2.1 标准贮备液 精密称取OTC、TC、CTC标准品各0.01 g，分别置于不同的10 mL棕色容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶解并定容至刻度，制备成1 mg/mL的标准品溶液，4 ℃冰箱避光保存，备用。
2.2.2 混合标准工作液 分别量取OTC、TC、CTC标准储备液各1 mL，置于100 mL 棕色容量瓶中，超纯水定容至刻度，此溶液中OTC、TC、CTC浓度均为10 μg/mL。以上标准溶液于4 ℃避光保存，备用。
2.3 样品处理称取5.00 g（±0.01 g）切碎的肉样（＜5 mm），置50 mL 锥形烧瓶中，加入5%高氯酸，定容至25 mL，于振荡器上振荡提取10 min，移入到离心管中，以3 000 r/min 离心10 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤。
2.4 测定按上述色谱条件，以保留时间定性、峰面积定量，用峰面积计算土霉素、四环素和金霉素的含量。
3 结果
3.1 线性关系分别取“2.2.2”中混合标准溶液30、40、50、60、80 μL 进样，按上述色谱条件进行测定。结果表明金霉素、土霉素、四环素在10～100 μg/mL 范围内线性关系良好，其线性方程和相关系数见表1。
表1 金霉素、土霉素和四环素的线性方程和相关系数
3.2 样品回收率与精密度实验取样品6份，每份分别加入混合标准溶液（添加水平见表2），按上述色谱条件进行回收率与精密度实验。结果见表2。结果表明，3个添加水平的回收率在78.50%～80.50%，相对标准差范围为2.71%～2.76%，表明该方法具有较高的灵敏度和精密度。
3.3 稳定性实验取样品溶液6 份，每份加入等量的“2.2.2”中混合标准溶液，分别在0、1、2、3、4和5 h进样，记录样品中色谱峰面积，计算RSD 为2.55%。结果表明金霉素、土霉素、四环素的混合标准溶液在5 h内稳定。
表2 样品回收率及精密度实验结果（n=6）
3.4 样品检测结果和讨论
3.4.1 样品检测结果 本批样品按上述色谱条件检测，均未检测出土霉素、四环素、金霉素。色谱图见图1、2。
图1 混合标准溶液的色谱图
图2 样品色谱图
3.4.2 讨论 实验中，首先以GB/T 5009.116—2003规定，采用乙腈：磷酸二氢钠溶液（35：65）作为流动相体系时，基线平稳，出峰时间适中，但土霉素与四环素未能有效分离，调整流动相比例也未能将二者有效分离。最后将流动相改为甲醇和磷酸二氢钠后，试验发现当甲醇：0.01 mol/L 磷酸二氢钠（20：80）时柱效较好，土霉素与金霉素能够有效分离，3种抗生素在20 min内达到基线分离，分离效果较好，且灵敏度高，无试剂峰干扰。
4 结论
本实验中所有样品均未检测出四环素类抗生素的残留，说明大理市下关镇采集的该批动物性食品中无四环素类抗生素残留。
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