鸽蛋低密度脂蛋白对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响

刘 杨，黄和璐，董海涛，金 一

(延边大学农学院，延吉 133002)

鸽蛋低密度脂蛋白对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响

刘 杨，黄和璐，董海涛，金 一*

(延边大学农学院，延吉 133002)

旨在探究鸽蛋低密度脂蛋白(LDL)对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响。试验分为5组，分别是鲜精组、3%LDL(-80和-196 ℃)处理组、9%LDL(-80和-196 ℃)处理组。采用CASA系统分析不同处理组添加不同浓度鸽蛋LDL对冷休克及冻融前后猪精子生物学性状的影响；通过SDS-PAGE、Western blotting、PCR扩增检测分析HSP70蛋白及凋亡基因表达量的变化。结果表明：猪精子经过冻融处理后，热休克蛋白HSP70的表达量高于鲜精组，同时添加9%鸽蛋LDL并置于-196 ℃保存的冻融精子的热休克蛋白HSP70的表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05)；在抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l试验中，鲜精组的基因表达量均高于其他处理组，添加9%LDL(-196 ℃)处理组的基因表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05)；在促凋亡基因Bak试验中，鲜精组的基因表达量最低，且添加9%LDL(-196 ℃)处理组的Bak基因表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05)。添加鸽蛋LDL可在一定程度上降低猪精子在冻融过程中造成的损伤，维持猪精子正常生物学性状，提高猪精子存活率。

猪精子；冷休克；冻融；LDL；HSP70；凋亡相关基因；

人工授精使用的新鲜精液普遍面临保存时间短的难题，釆集的新鲜精液经过洗精稀释处理，在15～20 ℃条件下只能保存3～5 d[1]，将精液冷冻才能达到长期保存的目的。目前关于牛[2]、羊[3]精液冷冻保存技术的研究已取得重大进展，但在对猪精液冷冻保存方面的研究较少。J.M.Morrell等[4]研究结果表明，猪精子细胞膜的组成成分与牛精子有所不同，主要差异在于猪精子内胆固醇与磷脂的比例较低，且细胞膜内外的胆固醇含量不对称。降低冷休克对猪精子的影响，并防止过氧化物对精子的损伤是猪精子冷冻保存的关键。冷冻解冻后猪精子细胞膜的通透性增加，导致精子细胞膜破损、膜脂质过氧化损伤，使精子质量严重下降[5]。为了更好地适应低温环境，维持自身正常的生命代谢，精子内部会发生一系列变化[6]，如温度和渗透压的变化等。但猪冷冻精液在解冻后仍存在活率低、受胎率低、窝平均产仔数少[7-8]的现象，因此寻找合适的冷冻保护剂是猪精液冷冻保存的主要研究方向。

卵黄是精液稀释液的常规组分，卵黄中对精子起保护作用的有效成分是磷脂和低密度脂蛋白(LDL)[9]。侯丽鹏等[10]报道，鸵鸟蛋中提取的LDL对冷冻后的猪精子有一定保护作用，其中添加8 g·mL-1的LDL的效果最好，但鸵鸟蛋中提取的LDL的冷冻保护效果并没有鸽蛋和鸡蛋理想。

在冻融过程中，精子由于应激会产生HSP70(Heat stress protein 70)，HSP70是由一个单一外显子编码的含有641个氨基酸的蛋白质[11]，可以通过增强细胞对外界损伤的耐受程度，维持细胞的正常代谢功能，且与哺乳动物精子的生成密切相关[12]。目前对热应激蛋白的研究主要集中在人类及其他动物的疾病方面，而对于热应激蛋白作用于精子的研究还处于起步阶段。S.Y.Huang等[13]分析了HSP70的表达量和猪精液质量之间的关系，结果显示在较为炎热的季节，猪精子内HSP70的表达水平显著降低，这可能与精液质量有关。M.D.Dun等[14]研究发现HSP70与新生多肽相关联，有助于蛋白质折叠，并且能够在精子形成期间完成蛋白质组装。S.Nikbin等[15]研究结果表明，在热带地区HSP70的单核苷酸多态性可能会不同程度的影响精液品质，尤其是对解冻后的精液品质影响很大。M.Yeste等[16]研究也证实HSP70的表达可能会产生一种能够包裹自身和外来抗原的新免疫物质，从而抑制细胞凋亡。1972年J.F.Kerr等[17]根据形态学特征，首先提出细胞凋亡(Apoptosis)一词。Bak基因参与细胞凋亡的调控，但也受到同族的很多基因(如Bcl-2l、Bcl-xl)的影响[18]。抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l在人体的各个组织中都有不同程度的表达[19]。Bak可以单独缓解Bcl-2l、Bcl-x1的抑凋亡活性，并且能够直接激活凋亡途径或是作为细胞死亡过程中的组成部分被活化，进而促进细胞凋亡。冻融可导致猪精子的理化特性发生变化，并造成一定程度的损伤，加速精子死亡过程[20]。Y.J.Jeong等[18]发现精子生存能力的延长可能与促凋亡基因和抗凋亡基因的平衡有关。目前对于精液冷冻保存的研究，大多集中于不同稀释液对精液冷冻质量的影响以及对适宜冷冻稀释液配方的研究。关于在稀释液中添加不同成分提高精子活力的作用机理以及影响冻融后精子活力的相关基因、蛋白及其相互作用原理的研究相对较少。

本研究通过探究在冻融条件下向猪精子中添加不同浓度的鸽蛋LDL对猪精液品质、顶体完整性、HSP70表达以及凋亡基因Bak、Bcl-x1、Bcl-2l表达的影响，进一步为猪冷冻精液保存技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验所用猪精液均来自吉林省延吉市人工授精站的成年健康长白猪。采集的精液稀释后用保温瓶密封存放，在25 ℃条件下，2 h内运回实验室。用于试验的精液必须符合：①颜色为乳白色；②活率>80%；③顶体完整性>75% 3个条件。

1.2 试验药品

Tris、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaHCO3、KH2PO4、Hepes、EDTA、TEMED、二抗(Anti- Rabbit IgG peroxidase conjugate)均购自Sigma公司。预染 Marker、免疫印迹一抗HSP70、纯化RNA试剂盒(High pure RNA isolation kit)、SYBR GreenⅠ染料均购自北京华夏远洋生物科技有限公司。反转录试剂盒(Reverse transcription system)购自Promega公司。

1.3 试验仪器

精子自动分析仪(Computer aided sperm analysis，CASA)、超高速离心机、台式微量高速离心机、凝胶成像系统、旋祸混合器、二氧化碳培养箱、冰箱、恒温水浴锅、电热恒温干燥箱、生物显微镜、振荡仪、低温高速离心机、垂直电泳槽、石墨半干转膜仪、PCR扩增仪。

1.4 溶液配置

PBS配制：NaCl 7.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g (或Na2HPO41.44 g)和K2HPO41.8 g，溶于800 mL蒸馏水，加蒸馏水定容至1 L。保存于4 ℃冰箱中即可。细胞裂解液配制：100 mL RIPA裂解液(强)分装1 mL·个-1，使用前加入PMSF，使PSMF的最终浓度为1 mmol·L-1。抗体稀释液(TBST缓冲液)：20% Tween 20 1 mL，TBS缓冲液400 mL，混合后即可使用，现用现配。冷冻基础液：TRIS 2.42 g、柠檬酸1.48 g、葡萄糖1.1 g 溶于100 mL去离子水中；冷冻基础Ⅰ液：冷冻基础液中加20%鸡卵黄(v/v)；冷冻基础Ⅱ液：冷冻基础液中加9%甘油(v/v)；冷冻基础Ⅲ液：冷冻基础液中加入9% LDL；冷冻基础液中加入3% LDL。

1.5 试验方法

1.5.1 LDL的提取 釆用M.Moussa等[21]方法提取LDL。收集鸽蛋卵黄，用等体积的NaCL溶液(0.17 mol·L-1)稀释卵黄，4 ℃搅拌1 h。搅拌均匀后，4 ℃ 10 000 r·min-1离心45 min。取上清液，4 ℃ 10 000 r·min-1离心，至彻底除去卵黄中的颗粒物质为止。取上清液加入等体积40%的(NH4)2SO4溶液，4 ℃搅拌1 h。搅拌均匀后，4 ℃ 10 000 r·min-1离心30 min。取上清液，透析6 h，然后4 ℃ 10 000 r·min-1离心30 min，离心分离后的上层漂浮物即为LDL。

1.5.2 精液冷休克处理 在平衡后的精液中分别加入含有3%和9%鸽蛋LDL的冷冻基础Ⅲ液，置于计算机控制的水浴中，使精液迅速从室温冷却到4 ℃，移至4 ℃冰箱中平衡30 min，静置待用。

1.5.3 精液冻融处理 精液经过常温保存液稀释后，PBS洗涤，800 r·min-1离心10 min，去上清液，分别加入含有3%和9%鸽蛋LDL的冷冻基础Ⅲ液，用纱布将试管包裹后放入冰箱，缓慢降温至4 ℃，然后以2∶1(v/v)分别加入冷冻基础Ⅱ液。混匀后装入0.5 mL精细管中，分别置于-80和-196 ℃的低温环境冻存。解冻时从液氮中取出精细管后快速放入42 ℃的恒温水浴锅中，解冻6 s后取出，将精液放入离心管内，加入等体积的PBS，800 r·min-1离心10 min，除去上清液，添加等量的PBS重悬，800 r·min-1离心10 min，备用。

1.5.4 猪精子品质检测 对新鲜猪精子、冷休克猪精子(未添加LDL组、添加3%LDL和9%LDL组)、冻融猪精子(-80 ℃添加3%LDL和9%LDL组、-196 ℃添加3%LDL和9%LDL组)用CASA系统进行检测，检测数据为重复3次以上的试验平均值。

1.5.5 考马斯亮蓝染色(CBB染色法) 吸取20 μL冻融猪精子：1)-80 ℃下添加3% LDL；2)-196 ℃下添加3% LDL；3)-196 ℃下添加9% LDL；4)-80 ℃下添加9% LDL)，用PBS重悬，涂片后晾干，用CBB染色液染色5 min，用三蒸水冲洗玻片，晾干后封片。在普通光学显微镜下观察猪精子顶体完整性。

1.5.6 精子全蛋白的提取 将不同处理组的猪精子用PBS洗涤，离心后用细胞裂解液重悬，置于摇床上震荡20 min。裂解后，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，-20 ℃冻存待用。

1.5.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 蛋白上样量为30 μL，电泳条件为5%浓缩胶40 mA，10%分离胶80 mA，电泳3～4 h，观察溴紛蓝线移动至距离凝胶板底部1 cm处即停止电泳，取出凝胶放入考马斯亮蓝染色液中染色，脱色。

1.5.8 免疫印迹(Western blotting) 剪20张滤纸和1张PVDF膜，大小与待转印凝胶相同，将滤纸和PVDF膜在转膜液中浸泡20 min。按照阳极、10层滤纸、PVDF膜、凝胶、10层滤纸、阴极的顺序依次摆放。恒流电转印25 min。转印结束后，用TBST洗膜，然后加包被液，室温下平稳摇动2 h。弃包被液，用TBST洗膜。加入一抗，4 ℃放置12 h，弃一抗，用TBST洗膜。加入二抗，在室温下平稳摇动2 h，弃二抗，用TBST洗膜。加入显色液，避光显色直到出现条带，加入双蒸水终止反应，照相保存。1.5.9 PCR引物设计及合成 引物由上海生工生物工程有限公司合成，见表1。

表1 PCR引物序列

Table 1 The primer sequence

基因Gene序列(5'-3')Primersequence产物大小/bpProductsize登录号AccessionNo.GAPDHSenseAntisenseCTGCCCCTTCTGCTGATGCGACAACTTCGGCATCGTGGA151AF017079BakSenseAntisenseACCGACCCAGAGATGGTCACCAGTTGATGCCACTCTCGAA209AJ001204Bcl-21SenseAntisenseGAAACCCCTAGTGCCATCAAGGGACGTCAGGTCACTGAAT196NM214285Bcl-x1SenseAntisenseCTGAATCAGAAGCGGAAACCGGGACGTCAGGTCACTGAA210AF216205

1.6 总RNA的提取、反转录PCR及琼脂糖凝胶电泳

采用纯化RNA试剂盒(High pure RNA isolation kit)对不同处理组的猪精子进行RNA提取。反转录PCR按照Reverse Transcription System试剂盒说明书进行操作。反转录的cDNA进行PCR扩增，PCR扩增体系：TaqDNA聚合酶0.08 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL、dNTP混合物0.4 μL、MgCl20.8 μL、反转录10×缓冲液2 μL，加无核酸的水至终体积为20 μL。PCR扩增条件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，57 ℃5 s，72 ℃10 s，循环数45～50；梯度扩增；40 ℃30 s。分别取5 μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统拍照。

1.7 数据分析

采用SPSS17.0软件分析精子活率、顶体完整性和质膜完整性等试验数据，所有数据均以“平均数±标准差”表示，差异显著性标准为P<0.05。通过方差分析并用Duncans法进行多重比较。

2 结 果

2.1 不同处理对猪精液品质的影响

结果表明(表2～4)，不同处理对冷休克及冻融后猪精液品质有不同程度的影响，鸽蛋LDL能对冷冻解冻后的猪精子活率产生较好的保护效果，-196 ℃温度下添加9%鸽蛋LDL对解冻后猪精子活率、精子运动能力的保护作用最强，9%鸽蛋LDL对冷休克猪精子活率、精子运动能力的保护作用最强。

2.2 冷休克及冻融后猪精子顶体完整性评估

对不同处理组的冷休克及冻融猪精子用考马斯亮蓝染色方法染色，结果见图1、图2。顶体完整的标准：只有顶体为蓝色，且顶体边缘光滑的精子为具有完整顶体的精子类型。图1结果显示：冷休克后的猪精子组，除鲜精外，添加9%LDL处理组与其他组相比，具有较好的顶体完整性；图2结果显示：除鲜精外，冻融后的猪精子组，在-196 ℃下添加9%LDL的处理组与其他组相比具有较好的顶体完整性。

2.3 不同处理对HSP70蛋白表达量的影响

将5组猪精子样本进行SDS-PAGE分析，用HSP70抗体与酶标二抗进行处理，用GAPDH 做内参，HSP70蛋白的SDS-PAGE结果以及免疫印迹结果如图3，其中2、3、4、5处理组HSP70表达量略高于鲜精处理组；而4、5处理组间的表达量差异不明显；LDL浓度相同时，-80 ℃温度下，3、4处理组表达量高于-196 ℃的2、5处理组，温度相同时，添加3%LDL的3、5处理组表达量高于添加9%LDL的2、4处理组，3处理组表达量最高，说明添加9%LDL、-196℃处理组的冻融精子与鲜精样本最为相似。

2.4 凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l和Bak在不同处理组中表达

采用PCR扩增和DNA电泳方法对5个处理组样本抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l和促凋亡基因Bak进行分析(图4)。结果显示，Bcl-xl、Bcl-2l鲜精处理组的基因表达量均高于其他处理组；添加9%LDL、-196 ℃的Bcl-2l冻融精子处理组的基因表达量略高于除鲜精外的其他3个处理组，3%LDL、-80 ℃处理组的基因表达量最低；添加9%LDL、-196 ℃的Bak冻融精子处理组的基因表达量略低于除鲜精以外的其他3个处理组；3%LDL、-196 ℃处理组的基因表达量最高。

表2 不同处理对冷休克后猪精液品质的影响

Table 2 Effects of different treatments on quality of cold shock pig sperm

项目Item鲜精Freshsperm未添加LDLNotaddLDL添加3%LDLAdd3%LDL添加9%LDLAdd9%LDLA级精子比例/%ProportionofgradeAsperm65.10±9.33a9.40±1.14b10.10±5.46b18.90±1.52bB级精子比例/%ProportionofgradeBsperm13.40±1.53a5.30±5.03b4.90±4.28b7.40±3.67abC级精子比例/%ProportionofgradeCsperm16.00±4.56a38.80±8.68b42.00±5.47b47.50±4.74bD级精子比例/%ProportionofGradeDsperm5.40±4.01a46.60±0.83b42.90±1.83b26.10±1.71cVCL9/(μm·s-1)43.20±8.69a14.60±1.39b6.70±4.92b17.00±1.40bVSL/(μm·s-1)23.30±2.18a4.90±0.33b3.60±3.50b7.50±1.39bVAP/(μm·s-1)39.30±7.37a12.70±1.98b6.10±4.63b16.10±4.60b

同一行中肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。VCL9.平均曲线运动速率；VSL.平均直线运动速率；VAP.平均路径运动速率；A级精子.快速向前运动的精子；B级精子.慢速或呆滞向前运动的精子；C级精子.非向前运动精子；D级精子.极慢或不动的精子。下同

Different superscripts letters in the same line represents a significance at (P<0.05)；The same superscripts letters in the same line represents no significant difference(P>0.05).VCL9.Average curvilinear velocity；VSL.Average straight line velocity；VAP.Average path velocity；Grade A sperm.The sperm of fast forward movement；Grade B sperm.The sperm of slow or dead to move forward；Grade C sperm.The sperm of not fast forward movement；Grade D sperm.The sperm of extremely slow or does not move.The same as below

表3 不同处理对冻融猪精液品质的影响

Table 3 Effects of different treatments on quality of frozen-thawed boar sperm

项目Item鲜精Freshsperm-80℃-196℃3%LDL9%LDL3%LDL9%LDLA级精子比例/%ProportionofGradeAsperm65.10±9.33a3.20±0.40b5.50±3.46b3.40±1.47b11.40±2.13bB级精子比例/%ProportionofGradeBsperm13.40±1.53a5.90±1.94b6.60±1.79b7.00±0.52b13.60±0.83bC级精子比例/%ProportionofGradeCsperm16.00±4.56a16.50±1.74a18.40±2.74a18.00±1.57a25.50±1.20abD级精子比例/%ProportionofGradeDsperm5.40±4.01a74.20±1.27b69.50±0.67c71.50±0.31bc50.30±0.67dVCL9/(μm·s-1)43.20±8.69a17.20±1.15b18.60±4.57b18.40±2.37b19.20±0.38bVSL/(μm·s-1)23.30±2.18a6.30±0.67b8.30±2.83b7.60±2.77b9.70±1.05bVAP/(μm·s-1)39.30±7.37a15.00±0.99b16.50±4.22b16.30±1.91b18.70±0.24b

表4 鲜精和添加LDL的冻融后猪精液品质

Table 4 Sperm quality of fresh and LDL supplemented frozen-thawed boar semen

%

a.鲜精；b.未加LDL；c.添加3% LDL；d.添加9% LDL a.Fresh sperm；b.Not add LDL；c.Add 3% LDL；d.Add 9% LDL图1 不同处理的冷休克猪精子考马斯亮蓝染色结果 20×Fig.1 CBB staining on boar cold shock sperm with different treatments 20×

a.鲜精；b.3% LDL(-80℃)；c.9% (-196℃)；d.3% LDL(-196℃)；e.9% LDL(-80℃)a.Fresh sperm；b.3% LDL(-80℃)；c.9%(-196℃)；d.3% LDL(-196℃) ；e.9% LDL(-80℃)图2 不同处理的冻融猪精子考马斯亮蓝染色结果 20×Fig.2 CBB staining on boar frozen-thawed sperm with different treatments 20×

M.Marker；1.鲜精；2.9% LDL(-196℃)；3.3% LDL(-80℃)；4.9% LDL(-80℃)；5.3% LDL(-196℃)。下同M.Marker；1.Fresh sperm；2.9%LDL(-196 ℃)；3.3%LDL(-80 ℃) ；4.9%LDL(-80 ℃)；5.3% LDL(-196 ℃).The same as Fig.4图3 5种处理猪精子HSP70蛋白表达的免疫印迹结果Fig.3 The results of the expression of HSP70 with 5 treatments by Western blotting

图4 5种处理组猪精子凋亡基因的PCR结果Fig.4 The results of apoptotic gene with 5 treatments by PCR

3 讨 论

3.1 温度和鸽蛋LDL对猪精子品质和顶体完整性的影响

精子活力及其运动性在冻融后普遍下降是因为冻融对精子内的抗氧化酶造成持续性伤害，并引发更多活性氧(ROS)的产生，活性氧自由基会使精子膜上的脂质过氧化，进而引起细胞损伤、凋亡甚至使精子基因变化。而LDL可在冻融过程中保护精子内抗氧化酶的活性，从而有效提高精子活率。S.Büyükleblebici等[22]研究结果表明，在精液中补充不同抗氧化剂能够降低顶体异常率。卵黄中对精子起冷冻保护作用的有效成分是磷脂和低密度脂蛋白(LDL)[23]。在猪精液的冷冻保存过程中，添加LDL能够抑制脂质过氧化，且对猪精子的活率以及活动能力都有一定的保护作用[24]。本研究结果表明，添加9%鸽蛋LDL并置于-196 ℃的处理组对冷休克以及冻融后的猪精子活率、精子运动能力的保护作用最强。这与吕瑞凯等[25]研究证实的添加0.09 g·mL-1鸽蛋LDL的冻存猪精子解冻后，精子活率达到47.33%，顶体完整性达到62.57%结果基本相似，产生这种现象的原因可能是由于鸽蛋 LDL含有的特殊结构，LDL含有0%～15%的蛋白质和85%～90%的脂质，并以甘油三酯为核形成一种膜状物[26]。精子在冻融过程中，鸽蛋LDL的结构损坏并破裂，使其内部的甘油三酯和磷脂进入精液，并在精子细胞外壁形成凝胶膜，以此降低冻融过程中物理和化学因素对精子造成的损伤。

3.2 温度和鸽蛋LDL对HSP70表达的影响

热休克蛋白具有的一些内在和外在因素可能导致DNA-蛋白质损伤，阻碍蛋白质合成，干扰细胞周期并引起细胞非正常凋亡，进而导致精子异常[27]。本试验结果发现，添加9%鸽蛋LDL并置于-196 ℃条件下处理组冻融精子的HSP70表达量与鲜精样本最为相似，并且随着温度的降低，HSP70的表达量逐渐降低，这与王艳风[28]提出的随着冷冻过程的进行，HSP70基因的表达量逐渐降低，而新鲜精子的基因表达量显著高于平衡后的精子(P<0.05)，平衡后精子基因的表达量又显著高于解冻后的精子(P<0.05)的结论相似。说明猪精子在冻融过程中受到冷冻损伤后促使HSP70蛋白表达，这可能是由于细胞受到应激伤害后，HSP70以分子伴侣的身份与异常蛋白质分子的亲水表面紧密结合，保护蛋白分子构型以维持正常细胞的生存功能。添加9%鸽蛋LDL处理组的HSP70的表达量比添加3%鸽蛋LDL处理组的表达量高，这与D.Kong等[29]研究的添加9%鸽蛋LDL，200 mmol·L-1的海藻糖，9%甘油组合能保护冻融后精子的结果相似，说明鸽蛋LDL能够在冻融过程中保护猪精子内抗氧化酶的活性，避免精子损伤。江中良[30]研究LDL对猪精子冻融后凋亡样变化产生的影响后证实，在猪精液冷冻稀释液中添加不同浓度(6%～10%)的LDL，对促进猪冷冻解冻后精子的存活，降低冷冻解冻诱导的凋亡样变化以及与凋亡相关的部分基因的表达有明显作用。HSP70的保护作用是通过促进变性蛋白的复性来维持蛋白的正常结构，或水解变性蛋白以促进新老蛋白交替实现的。因此从各个角度深入研究HSP70对免疫学、调节细胞凋亡、抗氧化、胚胎发育、调控细胞周期等多个方面都将有重要意义。

3.3 温度和鸽蛋LDL对猪精子抗凋亡基因Bcl-2l、Bcl-xl和促凋亡基因Bak表达的影响

研究表明，冻融可使人[31]、牛[32]精子细胞活性降低、线粒体膜电位降低等与细胞凋亡相关特征的发生。当细胞中Bax基因表达结束时，细胞凋亡加速。这似乎表明，Bax与Bcl-2l会组成异质二聚体，进而抑制Bcl-2l蛋白对细胞存活的影响[33]。抗凋亡基因Bcl-2l成员中的BH3结构域是调控细胞凋亡的关键性结构域，可封闭促凋亡基因，并且从根本上阻止Bax和Bak基因的活化，从而抑制细胞凋亡事件的发生[33]。在本研究中，用PCR扩增的方法分析冻融处理后猪精子凋亡基因的表达量。结果显示在抗凋亡基因Bcl-xl和Bcl-2l处理组中，鲜精处理组的基因表达量高于其他处理组，添加9%LDL、-196 ℃条件下冻融精子处理组的Bcl-xl、Bcl-2l基因表达量与鲜精组相似，说明在此温度下9%鸽蛋LDL能够降低细胞损伤，阻碍细胞凋亡，这与江中良[30]首次提出在冷冻保存后的猪精液中添加9%～10%的LDL后，BCL-2l的基因表达量显著上升的结论基本相似。添加9%LDL、-196 ℃的Bak基因冻融精子处理组的基因表达量略低于除鲜精以外的其他3个处理组。这一结果似乎也表明冻融诱导的细胞凋亡广泛存在，并与Y.J.Jeong等[24]研究发现的冻融过程可以诱导精子的凋亡相一致。似乎说明精子存活能力的延长可能与促凋亡基因和抗凋亡基因的平衡有关。造成以上原因的结果还需更深层次的研究。

4 结 论

本试验各处理组中猪精子热休克蛋白HSP70的表达量均高于鲜精组，其中添加9%鸽蛋LDL、-196 ℃冻融精子热休克蛋白HSP70的表达量与鲜精组无显著差异；在抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l处理组中，鲜精处理组的基因表达量均高于其他处理组；而添加9%LDL、-196 ℃冻融精子处理组Bcl-2l基因的表达量与鲜精相似；添加9%LDL、-196 ℃冻融精子处理组的Bak基因表达量与鲜精最接近；且添加3%LDL、-196 ℃冻融处理组的Bak基因的表达量最高。

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(编辑 程金华)

Effect of LDL from Pigeon Egg Yolk on the Expression of HSP70 and Apoptosis-related Gene in Cold Shock and Frozen-thawed Boar Spermatozoa

LIU Yang，HUANG He-lu，DONG Hai-tao，JIN Yi*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China)

The purpose of this study is to investigate the effects of LDL from pigeon egg yolk on expression of HSP70 and apoptosis related genes in cold-shocked and frozen-thawed boar spermatozoa.This study divided into 5 groups：fresh sperm group，3% LDL(-80 and -196 ℃) treatment groups，9%LDL(-80 and -196 ℃)treatment groups.The addition of LDL with different concentrations has effect on biological features of the spermatozoa before and after cold-shock and frozen-thawed treatments ，which was analysed by CASA，and changes in expression of HSP70 and apoptosis-related genes were analysed and checked by SDS-PAGE，Western blotting and PCR.The results showed that：HSP70 expression was higher than that of fresh sperm after freezing，there was no significant difference between HSP70 expression of frozen-thawed stored at -196 ℃ with addition of 9% pigeon egg and fresh spermatozoa in treatment group(P>0.05)；in the experiment of anti-apoptosis geneBcl-x1，Bcl-21，gene expression in fresh sperm treatment group was higher than other treatment groups(P>0.05)；in the expression of pro-apoptoticBakgene，the expression of fresh sperm was the lowest，there was no significant difference betweenBakgene of the 9% LDL(-196 ℃) treatment group and fresh spermatozoa in treatment group(P>0.05).Addition of LDL from pigeon egg yolk could reduce the damage caused by freezing and thawing，maintain biological features and improve the survival of the pig spermatozoa.

boar spermatozoa；cold shock；LDL；frozen-thawed；HSP70；apoptosis-related gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.009

2015-01-15

国家自然科学基金(31260529)；吉林省科技厅重点科技攻关项目(20150204079NY)

刘 杨(1990-)，女，青海人，硕士生，主要从事动物繁殖与生物技术研究，E-mail：599295340@qq.com

*通信作者：金 一，教授，E-mail：yijin@ybu.edu.cn

S813.3

A

0366-6964(2015)06-0940-09