新疆贝母属药用贝母总生物碱含量测定研究

任慧梅，张鹏葛，王 倩，盛 萍，2*，史 红，2，张 煊

(1.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011；2. 新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

新疆贝母属药用贝母总生物碱含量测定研究

任慧梅1，张鹏葛1，王 倩1，盛 萍1，2*，史 红1，2，张 煊1

(1.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011；2. 新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

目的：探讨新疆贝母属药用贝母中总生物碱含量测定的最佳方法，并比较其总生物碱含量差异。方法：用氯仿 ∶甲醇(4 ∶1)混合溶剂提取总生物碱；采用酸性染料比色法测定新疆贝母属药用贝母中总生物碱含量。结果：酸性染料选择溴麝香草酚蓝比色的显色条件为pH 5.0缓冲液4.0 mL；氯仿萃取1次，每次2.6 mL；无水硫酸钠脱水用量0.25 g。西贝素在 12.24～73.44 μg范围内呈良好的线性关系；平均回收率101.53 %，RSD为2.67 %(n=5)。所测生物碱的含量在新疆贝母属药用贝母种间存在一定差异，除滩贝母和小花贝母总生物碱含量相对较低外，其余6种贝母总生物碱含量在0.589%～0.869%之间，比以往文献测定的总生物碱含量均较高。结论：所建立的方法简便、精确，重复性好，可用于新疆贝母属药用贝母总生物碱含量的测定，其总生物碱含量为新疆贝母属药用贝母资源进一步开发利用提供科学依据。

新疆药用贝母；总生物碱；含量测定

贝母是一种常用中药，在我国有悠久的用药历史。为百合科贝母属(Fritillaria)多种植物的鳞茎，通常用于清热润肺、化痰镇咳、止喘、除燥的效用[1]。《中国药典》2010年版收载的贝母药材有川贝母、浙贝母、伊贝母、平贝母及湖北贝母，其中川贝母除包括历届版本收录的川贝母F.cirrhosaDon.、暗紫贝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia.、甘肃贝母F.przewalskiiMaxim.et Bata.、棱砂贝母F.delavayi. Franch.4种植物外，还新收录了太白贝母F.taipaiensisP.Y.Li和瓦布贝母F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C. Yue) Z.D. Liu,S. Wang et S.C.Chen 2种植物。伊贝母收载在《中国药典》历次版本中，包括新疆贝母F.walujewiiRege. 、伊犁贝母F.pallidifloraSchrenk 2种植物的干燥鳞茎[2]，在临床应用方面与药材川贝母相同，是中医处方和中成药生产常用的名贵药材。因其野生品种仅分布在新疆境内[3]，故新疆当地人也常将新疆贝母F.walujewiiRegel.或伊犁贝母F.pallidifloraSchrenk 的干燥鳞茎统称为新疆贝母。而实际上，随着野生伊贝母药材资源破坏严重，在新疆民间，同时入药使用的贝母尚有托里贝母F.tortifoliaX. Z. Duan et X. J. Zheng、小花贝母F.meleagroidesPatrin ex Schult.、裕民贝母F.yuminensisX. Z. Duan等7种药用贝母，几十年来不仅供应本区，还大量支援兄弟各省区，以弥补市场紧缺和供需矛盾，有望增补为伊贝母项下新品种，但有关其活性成分含量的对比研究鲜见。现代研究证明总生物碱是贝母类药材的主要活性成分[4]，而测定总生物碱的常用方法之一多为酸性染料比色法[5-10]，但酸性染料的选择及显色条件的不同对总生物碱含量测定结果的准确性影响较大。课题组前期对新疆贝母属药用贝母总生物碱含量测定选择何种酸性染料及显色条件进行了详细研究，为促进新疆贝母属药用贝母的合理开发利用及资源保护，同时，为临床合理用药提供科学依据。

1 仪器与材料

本实验所用新疆贝母属药用贝母药材均于2012-2013年5月采自新疆各产地，生长年限均为3年生，药材样品信息见表6。经鉴定为百合科植物新疆贝母FritillariawalujewiiRegel、伊犁贝母F.pallidifloraSchrenk、托里贝母F.tortifoliaX.Z.Duan et X. J. Zheng、滩贝母F.karelinii(Fisch.) Baker.、小花贝母F.meleagroidesPatrin ex Schult.、裕民贝母F.yuminensisX. Z. Duan、黄花贝母F.verticillataWilld.、大白花贝母F.verticillatavar.albidoflora等的干燥鳞茎。凭证标本存放于新疆医科大学中医学院中药资源教研室。药材经60 ℃烘干后粉碎，过80 目筛，备用。对照品西贝素(批号110767-201005)购于中国药品生物制品检定所。

AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司 )；DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；GBC-40紫外-可见分光光度计(澳大利亚产 )；雷磁pH计；水浴锅等。

pH 4.2溴甲酚绿溶液(用由0.1 mol·L-1的邻苯二甲酸氢钾与0.2 mol·L-1的氢氧化钠配制成的pH 4.2的缓冲溶液定容装有0.125 0 g溴甲酚绿粉末的250 mL容量瓶得到)；pH 5.0溴麝香草酚蓝溶液(用由0.1 mol·L-1的邻苯二甲酸氢钾与0.2 mol·L-1的氢氧化钠配置成的pH 5.0的缓冲溶液定容装有0.1250 g溴麝香草酚蓝粉末的250 mL容量瓶得到)、氯仿、甲醇、氨水、无水乙醇、无水硫酸钠等，所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

2.1.1 对照品溶液

精密称取0.005 1 g西贝素置5 mL容量瓶中，用少量氯仿溶解，并用氯仿定容至刻度，从中精密移取3 mL至25 mL容量瓶中并用氯仿定容至刻度(0.122 4 mg.mL-1)，备用。

2.1.2 样品溶液

精密称取样品粉末(过80目筛)约1.000 0 g置250 mL圆底烧瓶，加入浓氨试液2 mL，密塞浸润12 h后精密加入氯仿-甲醇(4 ∶1)混合溶液30 mL，轻摇混匀，置80℃水浴加热回流提取4 h，室温下滤纸滤过，用氯仿-甲醇(4 ∶1)洗涤烧瓶2～3次，洗涤液一起过滤。滤液置已干燥至恒重的蒸发皿中，60 ℃水浴上蒸干后，在60 ℃烘箱中干燥3 h，干膏加少量氯仿分次溶解，定量移入25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，备用。

2.2 显色试剂及测定波长的选择

精密吸取西贝素对照品溶液及样品溶液各2份，每份0.2 mL于25 mL容量瓶中，分别精密加入pH 4.2溴甲酚绿溶液和pH 5.0溴麝香草酚蓝溶液4 mL，再加氯仿2.6 mL密塞，剧烈振摇5 min，移入分液漏斗中静置分层，分取氯仿层于装有0.25 g无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，于波长200～700 nm范围内扫描测定吸收光谱。各供试液用pH 4.2溴甲酚绿溶液和pH 5.0溴麝香草酚蓝溶液显色前后的吸收光谱见图1。

图1 各供试品溶液显色前后吸收光谱

图2 对照品与样品测定波长的吸收光谱

重复试验发现，用pH 4.2溴甲酚绿显色，西贝素对照品和样品显色后的λmax变化较大，重现性和稳定性较差，不宜采用。而用pH 5.0溴麝香草酚蓝显色后，西贝素对照品和样品λmax 不仅一致，均为414 nm，而且重现性好，故选用pH 5.0溴麝香草酚蓝溶液显色，测定波长选择 414 nm。

2.3 显色条件考察

2.3.1 缓冲溶液pH值考察

精密吸取样品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分别精密加入pH 4.6、 4.8、 5.0、5.2、5.4溴麝香草酚蓝溶液4 mL，再加入氯仿2.6 mL，依法在414 nm下测定吸光度。结果见表1。结果显示用pH 5.0溴麝香草酚蓝溶液显色，吸光度最大。

表1 缓冲溶液pH 值考察

2.3.2 酸性染料用量考察

精密吸取样品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分别精密加入pH 5.0的溴麝香草酚蓝溶液2、3、4、5、6 mL，再加入氯仿2.6 mL，依法在414 nm下测定吸光度。结果见表2。结果显示用pH 5.0溴麝香草酚蓝溶液用量为4 mL时，已能使生物碱与其完全结合，被充分萃取，吸光度达到最大。

表2 酸性染料用量考察

2.3.3 氯仿用量考察

精密吸取样品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分别精密加入pH 5.0的溴麝香草酚蓝溶液4 mL，再分别加入氯仿2.4、2.5、2.6、2.7、2.8 mL，依法在414 nm下测定吸光度。结果见表3。结果显示，氯仿用量达2.6 mL时，即可将生物碱与酸性染料的络合物基本萃取完全。

表3 氯仿用量考察

2.3.4 显色稳定性

精密吸取样品溶液0.2 mL于25 mL容量瓶中，精密加入pH 5.0的溴麝香草酚蓝溶液4 mL、氯仿2.6 mL，依法在414 nm下测定吸光度。结果见表4。由结果可知，氯仿萃取液放置30 min 基本稳定。

表4 显色稳定性考察

2.3.5 无水硫酸钠用量考察

精密吸取样品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分别精密加入pH 5.0的溴麝香草酚蓝溶液4 mL，氯仿2.6 mL，剧烈振摇5 min，静置分层于装有0.20、0.25、0.30 g无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，于414 nm的波长下测定吸光度。结果见表5。结果显示，当用量为0.25 g时吸光度较为理想，用量过少，不能起到吸收水分的作用，用量过大会吸附生物碱络合物。

表5 无水硫酸钠用量考察

2.3.6 线性关系考察

从西贝素对照品溶液(0.122 4 mg·mL-1)中精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 与0.6 mL分别至25 mL容量瓶中，分别精密加入pH 5.0的溴麝香草酚蓝溶液4 mL、氯仿2.6 mL，密塞，振摇均匀后，移入分液漏斗中静置30 min，分取氯仿层于装有0.25 g无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，在414 nm 处测定吸光度。以西贝素量μg为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得到回归方程：

A=0.008 7C+0.057 3(R2=0.999 1)，结果表明西贝素在 12.24～73.44 μg范围内呈良好的线性关系。

2.3.7 精密度考察

精密吸取对照品溶液5份，每份0.2 mL于25 mL容量瓶中，按样品含量测定项下方法测定吸光度。结果表明，该方法精密度良好。

2.3.8 重现性考察

取同一样品粉末5份，每份约1.000 0 g，精密称定，按样品溶液制备项下方法进行制备。精密吸取0.2 mL于25 mL容量瓶中，按样品含量测定项下方法测定吸光度。结果表明，该方法重现性良好。

2.3.9 稳定性考察

取同一样品粉末，分别于配置溶液后0、1、2、3、4、6、8 h, 精密吸取0.2 mL至25 mL容量瓶中，加pH 5.0的溴麝香草酚蓝4 mL，氯仿2.6 mL，按样品含量测定项下方法测定吸光度，平均值为0.452，RSD为0.8%。结果表明样品溶液在8 h内稳定。

2.3.10 回收率试验

取已知总生物碱含量的样品粉末(总生物碱含量为0.65%) 5份，每份0.5 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，分别精密吸取含有西贝素80%、100%、120%样品中总生物碱量加入样品中，按样品溶液制备项下方法进行制备，按样品含量测定项下方法测定吸光度，计算平均回收率为101.53 % (n=5)，RSD为2.67 % 。

2.3.11 样品含量测定

精密称取样品粉末(过80目筛)约(约1.000 0 g)，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加浓氨试液2 mL，浸润12 h。精密加入三氯甲烷-甲醇(4 ∶1)混合溶液30 mL，混匀，置80 ℃水浴加热回流提取4 h，放冷，用单层滤纸滤过，用三氯甲烷-甲醇(4 ∶1)混合溶液洗涤2～3次圆底烧瓶，洗涤液与样品液一起过滤后，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在60 ℃水浴上蒸干后，于烘箱中60 ℃干燥3 h，残渣加少量氯仿分次溶解，定量移入25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀。精密吸取0.2 mL于25 mL容量瓶中，加入pH 5.0的溴麝香草酚蓝溶液4 mL、氯仿2.6 mL，密塞，振摇均匀后，移入分液漏斗中静置，分取氯仿层于装有0.25 g无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，在414 nm 处测定吸光度，计算含量，结果见表6。

表6 新疆贝母属药用贝母总生物碱含量测定结果(n=5)

3 讨 论

3.1 酸性染料比色法是测定总生物碱常用方法之一[5-10],它是在适当的pH介质中，生物碱与氢离子结合成盐，酸性染料在此介质中解离出阴离子，同时，阳离子和阴离子又能定量地结合成有色的离子对，离子对能被合适的有机溶剂提取形成有色溶液，因而可以供比色时测定含量。但酸性染料的选择对含量测定结果的准确性影响较大，我们在参考相关文献[5-10]基础上，对酸性染料溴甲酚绿和溴麝香草酚蓝进行了筛选。根据对照品和样品显色后的λmax,以及重现性和稳定性，选择溴麝香草酚蓝为酸性染料，可以较好地保证测定结果的重现、稳定和准确可靠。

3.2 采用酸性染料比色法测定总生物碱含量时，缓冲溶液pH值、酸性染料用量以及氯仿用量用量等方面对测定结果影响很大[5-10]，因此，我们对以上显色条件进行了详细的考察，结果以pH 5.0的溴麝香草酚蓝用量为4.0 mL时最佳。另外，为了能够实现生物碱和生物碱苷与酸性染料的络合物被氯仿充分萃取出来，本研究经试验筛选，氯仿用量为2.6 mL时萃取效果最佳。

3.3 试验中排除氯仿萃取液中水分的影响对试验测定结果至关重要,由于大量的无水硫酸钠对络合物有一定的吸附作用, 我们对无水硫酸钠的用量也进行了试验考察，结果以使用0.25g的无水硫酸钠脱水效果最佳。

3.4 目前国内文章中有关测定新疆药用贝母品种总生物碱含量的报道有文献[11-13]，测定总生物碱的方法有两相滴定法、酸性染料比色法和非水滴定法，但测定的总生物碱含量均较本试验低。在文献[11]中采用两相滴定法，新疆贝母Fritillariawalujewii总生物碱含量为0.117%；在文献[12]中分别采用两相滴定法、酸性染料比色法和非水滴定法，伊犁贝母Fritillariapallidiflora总生物碱含量分别为0.121%、0.087%、0.291%；1990年李萍在21种贝母总生物碱含量测定[13 ]中采用酸性染料比色法，测定出伊犁贝母Fritillariapallidiflora、新疆贝母F.walujewii、托里贝母F.tortifolia、滩贝母F.karelinii、小花贝母F.meleagroides、裕民贝母F.yuminensis总生物碱的含量分别为0.2%～0.27%、0.16%～0.20%、0.13%、0.16%、0.24%和0.20%。比较上述文献资料，本实验在对选择何种酸性染料及显色条件进行详细考察筛选后，测定到的新疆贝母属药用贝母总生物碱含量达到0.491%～0.869%之间，其中，药典收录的2个品种总生物碱含量达到0.718%～0.869%之多。

3.5 比较新疆贝母属8种药用贝母之间总生物碱含量，除滩贝母(0.501%)和小花贝母(0.491%)总生物碱含量相对较低外，其余6种贝母总生物碱含量在0.589%～0.869%之间。其中，裕民贝母(0.841%)、黄花贝母(0.619%～0.674%)、托里贝母(0.651%)、大白花贝母(0.589%)与药典收录的新疆贝母(0.721%～0.771%)和伊犁贝母(0.718%～0.869%)2个品种总生物碱含量差异较小。但是否可增补为药典品种，尚需结合《中国药典》伊贝母质量标准项下要求和药效试验进一步研究。目前，对其这方面的研究工作正在进行中。同时，本研究结果为进一步合理开发利用新疆贝母属药用贝母资源提供了重要理论基础和科学依据。

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Studies on Determination of Total Alkaloids in MedicinalFritillaria from the Genus Xinjiang Fritillaria

Ren Huimei1, Zhang Pengge1, Wang Qian1,Sheng Ping1，2*, Shi Hong1，2, Zhang Xuan1

(1.Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulas, Urumqi 830011, China;2.School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Objective: To investigate the optimum method of determination of total alkaloids in medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria, and a difference of total alkaloids contents in different species medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria were compared. Methods: The contents of total alkaloid in medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria were determined by acid dye colorimetry. Results： Bromothymol blue was selected as acid dye colorimetry, and acid dye color conditions：pH 5.0 buffer 4.0 mL. Chloroform extraction with 2.6 mL, and anhydrous sodium sulfate 0.25 g. Sipeimine in 12.24～73.44 μg range good linear relationship，average recovery was 101.53%，RSD was 2.67% (n=5)．There existed a little differences in total alkaloids contents in different species medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria. Total alkaloids contents in 6 species medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria were from 0.589 to 0.869 percent, while Total alkaloids contents inF.karelinii(Fisch.) Baker. andF.meleagroideswere relatively lower. Generally speaking, they all was relatively higher in total alkaloids contents between this study and previous literature. Conclusion：The method is simple，accurate, reproducible and can be used to determine total alkaloids in medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria. This provided a scientific basis for exploitation and utilization of medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria in the future with high content of alkaloids.

Medicinal Fritillaria from Xinjiang; total alkaloids; quantitative determination

2014-09-15

国家自然科学基金资助项目( 81160544)。

任慧梅(1989—)，女，在读硕士研究生。研究方向：从事特色中药资源质量标准研究工作。

*通讯作者：盛萍(1967—)，女，博士，教授，硕士生导师。研究方向：特色中药资源质量标准研究。E-mail: xjsphwy@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.02.007

R284.1

A

1006-9690(2015)02-0024-05