辅助性T 细胞17/调节性T 细胞与慢性乙型肝炎中医辨证分型的关系及意义*

刘肄辉 郭 艳 张永华 刘 莉 周红娟 冯 慧

1.浙江省中西医结合医院肝病科 (浙江 杭州，310003) 2.杭州市第三人民医院消化科

近年来的研究证实Th17 细胞和Treg 细胞在CHB的致病过程中有重要作用［1～3］。同时由于Th17 细胞有致炎作用，Treg 细胞有抗炎作用，Th17/Treg 失衡可能加重肝脏炎症或导致HBV 感染慢性化［3］。本研究旨在观察CHB 中Th17/Treg 失衡与中医证型的关系。

1 资料及方法

1.1 研究对象 选择浙江省中西医结合医院肝病科CHB 患者90 例、健康志愿者30 例，由浙江省中西医结合医院伦理委员会讨论通过并签署知情同意书。CHB诊断标准符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》，年龄、性别、病程等一般资料差异无统计学意义(P ＞0.05)。所有患者6 个月内未接受抗病毒治疗或免疫调节治疗。排除合并HAV、HCV、HEV 等病毒感染;排除合并脂肪性、酒精性和遗传代谢性肝病、失代偿性慢性肝病以及自身免疫相关的其他疾病;无心脑血管、肝、肾和造血系统重大疾病及精神病患者;排除妊娠或哺乳期妇女。中医辨证分型参照1991年中国中医药学会内科肝病专业委员会修订的“病毒性肝炎中医辨证标准”［4］，将患者分为湿热中阻、肝郁脾虚、肝肾阴虚型、瘀血阻络、脾肾阳虚5 型，由两名副主任中医师共同确定患者证型。

1.2 观察指标及检测方法

1.2.1 采用流式细胞术测定CHB 患者和健康志愿者外周血Th17、Treg 细胞水平。①检测外周血Th17 细胞:全血标本分离外周血单个核细胞(PBMC)，100μl无血清RPMI 1640 培养基等体积稀释PBMC 至200μl(含4 ×105个细胞)，接种于培养液，加1μg/ml PMA 工作液5μl、50μg/ml 离子霉素(Ionomycin)工作液4μl、0.1mg/ml 莫能菌素(Monensin)工作液3.4μl，37℃、5%CO2培养箱培养4～6 h。混匀，分为同型对照管和实验管(100μl)加入5μl CD3-FITC 抗体和5μl CD8-PE-Cy 抗体，室温避光孵育15 min。每管中加入100μl Fix＆Perm 中的Reagent A(即固定液)，室温避光孵育15 min;加入3ml PBS，1 200 rpm 离心5 min，弃上清。每管中加入100μl Fix＆Perm 中的Reagent B(即破膜和溶血)，同时同型对照管和实验管分别加入(Mouse IgG1-PE 和IL-17-PE)抗体各10μl，室温避光孵育15 min。每管中加入3ml PBS，1 200 rpm 离心5 min，弃上清;分别加入0.5ml PBS 重悬细胞，上机检测。②检测外周血调节性T 细胞:在每个流式上样管中加入100μl准备好的细胞悬液，细胞数约为1 ×106个。按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原CD4、CD25。用预冷的Flow Cytometry Staining Buffer 或预冷的PBS 洗涤细胞。旋涡震荡重悬细胞后加入1ml 的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，并再次旋涡混匀。避光4℃孵育30～60min。加入2ml Permeabilization Buffer(ebioscience，目录号00-8333)洗涤细胞并离心弃去上清液。重复上述操作洗涤细胞。加入Permeabilization Buffer 稀释的2%正常大鼠血清100μl，避光4℃孵育15min。封闭液无需洗去，直接加入稀释好的荧光标记Foxp3 抗体20μl，避光4℃孵育至少30min。加入2ml Permeabilization Buffer 洗涤细胞并离心弃去上清液。重复上述操作洗涤细胞。用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞，上机检测并分析。

1.2.2 检测HBV 血清标志物、ALT、HBV DNA 等指标。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0 软件，计量资料数据以±s 表示，两组均值比较采用t 检验，多组均值比较采用单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人员Th17、Treg、Th17/Treg 的比较 见表1。

表1 两组人员Th17、Treg 细胞的比较

2.2 CHB 中医不同证型中患者ALT 及Th17、Treg 细胞的变化 湿热中阻、肝郁脾虚两型患者ALT 水平最高，同时Th17 细胞、Th17/Treg 比值也最高，而Treg 细胞最低;随着其他3 型患者ALT 水平的下降，Th17 细胞逐渐降低，Treg 细胞逐渐升高，Th17/Treg 比值降低。湿热中阻型、肝郁脾虚型患者ALT 水平、Th17 细胞、Treg 细胞、Th17/Treg 比值与其他3 组间比较差异有统计学意义(均P ＜0.01);肝肾阴虚型、脾肾阳虚型、瘀血阻络型患者ALT 水平、Th17 细胞、Treg 细胞、Th17/Treg 比值差异无统计学意义(均P ＞0.05)。见表2。

表2 CHB 中医不同证型中ALT 及Th17、Treg 细胞的变化

3 讨论

Th17 细胞是新发现的CD4+T 细胞亚群，因其分泌促炎因子IL-17 而得名，主要与炎症和宿主的抗菌免疫相关［5，6］，研究已证实Th17 细胞与CHB 疾病进展及肝脏损伤有关［7，8］。另一类CD4+T 细胞亚群CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞被认为具有免疫抑制和抗炎作用［9～11］，Treg 细 胞 与CHB 的 发 生 发 展 有 密 切 关系［12～14］。Th17 与Treg 细胞在功能与分化上均有相关性［15～18］，都参与了CHB 的发病机理，Th17/Treg 失衡与CHB 的关系受到关注。有研究发现，CHB 中Treg/Th17比值与健康对照组相比明显降低，应用恩替卡韦抗病毒药物治疗后，外周血Th17 细胞频数升高，而Treg 细胞频数则减低，导致Treg/Th17 比值明显降低［19］。Zhai 等发现Th17/Treg 失衡与乙型肝炎相关性慢加急性肝衰竭的生存有关［20］。提示我们，Treg 和Th17 细胞的功能失衡可能是HBV 感染持续的重要原因。

本研究结果显示CHB 患者Th17、Treg、Th17/Treg均比健康对照组高，说明CHB 患者Th17/Treg 存在免疫失衡，为影响CHB 的重要因素。

CHB 中医辨证大致可分为湿热中阻型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、瘀血阻络型、脾肾阳虚型5 型。本研究发现湿热中阻、肝郁脾虚两型患者Th17 细胞增多，ALT 水平高，提示Th17 细胞可能有促进炎症的作用;伴随着Treg 细胞减少，提示Treg 对细胞毒性T 淋巴细胞(CTL 细胞)、Th17 细胞等效应细胞免疫抑制功能的减弱，从而促进了炎症的发生。但Th17/ Treg 比值主要与肝脏炎症有关，仅反映部分免疫状态，中医各证型与CHB 复杂的免疫调节网络的关系尚需深入研究。

中医认为CHB 的病因病机为“正虚邪盛”，现代医学认为CHB 存在免疫失调，决定着HBV 感染的发生、发展与转归。中医学的正气与现代医学的免疫学在本质上是一致的。结合本研究的结果，我们认为中医在辨证治疗CHB 的基础上应当重视“扶正”。以王灵台教授为代表的我国医学家提出了补肾法治疗CHB，取得了良好的疗效，而且相关研究及我们的前期研究均证实其机理与补肾法对CD4+T/CD8+T 细胞、Th1/Th2细胞、树突状细胞等的调节作用相关［21～25］。临床上与西药抗病毒药物联用时立法应有所改变，中医中药应侧重于扶正，以达到扶正固本、免疫调节的目的，从免疫调控方面研究中医药的作用机制值得深入探讨。

［1］Zhang Ji-Yuan，Song Chun-Hui，Shi Feng，et al.Decreased ratio of Treg cells to Th17 cells correlates with HBV DNA suppression in chronic hepatitis B patients undergoing entecavir treatment［J］.PLoS One，2010，5(11):e13869.

［2］Wang Qinghong，Zheng Yanhua，Huang Zemin，et al.Activated IL-23/IL-17 pathway closely correlates with increased Foxp3 expression in livers of chronic hepatitis B patients［J］.BMC Immunol，2011，12:25.

［3］Niu Yinghua，Liu Hongli，Yin Donglin，et al.The balance between intrahepatic IL-17(+)T cells and Foxp3(+)regulatory T cells plays an important role in HBV-related end-stage liver disease［J］.BMC Immunol，2011，12:47.

［4］中华中医药学会内科肝病专业委员会.病毒性肝炎中医辨证标准(试行)［J］.中医杂志，1992，(5):39 -40.

［5］O'Quinn Darrell B，Palmer Matthew T，Lee Yun Kyung，et al.Emergence of the Th17 pathway and its role in host defense［J］.Adv Immunol，2008，99，115 -163.

［6］Sieve Amy N，Meeks Karen D，Bodhankar Sheetal，et al.A novel IL-17-dependent mechanism of cross protection:respiratory infection with mycoplasma protects against a secondary listeria infection［J］.Eur J Immunol，2009，39(2):426 -438

［7］Zhang JY，Zhang Z，Lin F，et al.Interleukin-17-producing CD4(+)T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2010，51(1):81 -91

［8］Wu Wei，Li Jie，Chen Feng，et al.Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25(4):750 -757

［9］Sakaguchi S，Ono M，Setoguchi R，et al.Foxp3+CD25+CD4+natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease［J］.Immunol Rev，2006，212:8 -27.

［10］Baecher-Allan C，Brown JA，Freeman GJ，et al.CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood［J］.J Immunol，2001，167(3):1245 -1253.

［11］Sakaguchi Shimon.Naturally arising CD4+regulatory t cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses［J］.Annu Rev Immunol，2004，22，531 -562

［12］Stoop JN，van derMolen RG，Baan CC，et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection［J］.Hepatology，2005，41(4):771 -778

［13］Xu D，Fu JL，Jin L，et al.Circulating and liver resident CD4+CD25regulatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease progression in patients with Hepatitis B［J］.The journal of immunology，2006，177(1):739 -747

［14］Peng Guoping，Li Shuping，Wu Wei，et al.Circulating CD4+CD25+regulatory T cells correlate with chronic hepatitis B infection［J］.Immunology，2008，123(1):57 -65

［15］Mangan PR，Harrington LE，O’Quinn DB，et al.Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)-17 lineage［J］.Nature，2006，441(7090):231 -234

［16］Ichiyama K，Yoshida H，Wakabayashi Y，et al.Foxp3 Inhibits RORγt-mediated IL-17A mRNA transcription through direct Interaction with RORγt［J］.J Bio Chem，2008，283(25):17003 -17008

［17］Yang XO，Nurieva R，Martinez GJ，et al.Molecular Antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs［J］.Immunity，2008，29:44 -56

［18］Kitani A，Fuss I，Strober W.Regulatory T cells induce CD4 +CD25-Foxp3-T cells or are self-induced to become Th17 cells in the absence of exogenous TGF-beta［J］.J immunology，2007，178(11):6725 -6729

［19］Zhang JY，Song CH，Shi F，et al.Decreased Ratio of Treg Cells to Th17 Cells Correlates with HBV DNA Suppression in Chronic Hepatitis B Patients Undergoing Entecavir Treatment［J］.Plos One，2010 5:e13869.

［20］Zhai S，Zhang L，Dang S，et al.The ratio of Th-17 to Treg cells is associated with survival of patients with acute-on-chronic hepatitis B liver failure［J］.Viral Immunol，2011，24(4):303 -310.

［21］彭建平，陈晨，何芳，等.补肾法与健脾法对乙肝病毒感染免疫耐受期患者外周血树突状细胞功能的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2010，20(4):221 -224.

［22］李曼，姚嫣，高月求.补肾方对慢性乙型肝炎T 淋巴细胞免疫效应分子表达的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2009，19(5):266-268.

［23］张永华，韩颖，刘肄辉，等.健脾补肾法对核苷类似物治疗慢性乙型肝炎的增效作用及对CD4、CD8 的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2008，18(5):263 -265.

［24］刘肄辉，张永华.健脾补肾法对拉米夫定治疗慢性乙肝外周血树突状细胞调节Th1/Th2 的影响［J］.中国中医药科技，2009，16(5):345 -346.

［25］聂红明，王灵台，陈建杰，等.从整体免疫调控再论补肾法治疗慢性乙型肝炎的免疫学机制［J］.中西医结合肝病杂志，2013，23(6):368 -370.