肌细胞增强因子2A基因P279L变异与冠心病的关系*

西安市中心医院心内科(西安710003)

张 涛 慕玉东△ 马前峰

肌细胞增强因子2A基因P279L变异与冠心病的关系*

西安市中心医院心内科(西安710003)

张 涛 慕玉东△马前峰

目的：探讨肌细胞增强因子2A基因P279L变异是否与冠心病相关。方法：选择西北地区汉族人385例，采用酚氯法提取全基因组DNA，应用聚合酶链式反应、限制性内切酶反应体系结合测序的方法检测MEF2A基因多态性。结果：冠心病组L、P等位基因的频率分别为16.53%和83.47%；对照组L、P等位基因的频率分别为5.48%和94.52%,MEF2A-P279L基因型在冠心病组和对照组的分布存在显著性的差异(P<0.01),而且L等位基因的分布频率在冠心病组显著高于对照组(P<0.01)。结论：MEF2A-P279L基因型在冠心病组和对照组的分布有显著性差异，与冠状动脉病变的严重程度显著相关,L等位基因的携带者冠心病发病率显著高于非携带者,而且冠脉的病变更为严重。

2003年Wang等[1]发现了人类肌细胞增强因子2(Myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)编码的基因存在突变,目前国内对MEF2A-P279L的研究报道较少，为了明确MEF2A-P279L基因多态性对我国人群冠心病的影响，及MEF2A-P279L基因多态性的种族差异。本研究采用酚氯法提取全基因组DNA，应用聚合酶链式反应、限制性内切酶反应体系结合测序的方法检测385例西北地区汉族人的MEF2A基因多态性。

对象与方法

1 对 象 收集我科2011年1月至2012年12月期间行冠状动脉造影的住院患者，共385例。根据结果分为冠心病组239例，男152例，女87例，年龄55.6±10.3岁；对照组146例，男83例，女63例，年龄52.6±11.2岁；均为汉族人。两组在性别和年龄之间的差异无统计学意义；入选的研究病例均排除肝肾功能不全、肿瘤等疾病，而且所研究的病例之间无血缘关系。

2 方 法 ①标本收集：于入院次日清晨空腹采取20ml静脉血，离心后将上清液及血细胞分装于血浆试管和血细胞试管，于-80℃低温冰箱保存备用。②DNA的提取：采用酚氯法提取DNA，即血细胞经蛋白酶消化、采用苯酚和氯仿提取，然后采用异丙醇沉淀提取物等方法。③DNA的标本分析：采用分光光度计和琼脂糖电泳对已提取的DNA标本进行纯度和浓度的检测。用OD260(nm)和OD280(nm)分别来表示DNA和蛋白质的吸光度，用OD260/OD280的比值来表示DNA纯度。对于DNA片段是否降解可以采用琼脂糖电泳的方法进行识别。④PCR扩增MEF2A目的基因：PCR条件：反应体系总体积15μl，循环参数：94℃预变性4min，94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸7min。由陕西博森生物公司合成引物，引物如下：上游5’CACTTTATTGAATGATATTTTTCCCC 3’；下游5’AGGCATCATGCCCTTGCTTTA 3’。⑤RFLP检测MEF2A-P279L基因多态性：Dra I限制性内切酶1 μl(2.5 u/μl)，内切酶10×NEbuffer 2μl，PCR产物8-10μl，加去离子水致反应体系20μl。将反应体系置于37℃水浴箱过夜16～24h。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色对酶切产物进行分型。

3 统计学处理 所有数据经SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计数和计量资料分别用频数值及均数±标准差表示。采用χ2检验对等位基因频率及基因型频率进行差异性比较，P<0.05为差异有显著性。

结 果

1 MEF2A-P279L基因多态性的分布 见表1、2。冠心病组L、P等位基因的频率分别为16.53%和83.47%，对照组的L、P等位基因的频率分别为5.48%和94.52%，两组间等位基因分布频率存在显著性差异，冠心病组的L等位基因分布频率显著高于对照组(P<0.01)

表1 MEF2A-P279L多态性的分布

表2 MEF2A-P279L等位基因频数的分布

2 MEF2A-P279L与冠脉病变支数的相关性 见表3、4。MEF2A-P279L不同基因型与显著性冠脉病变以及严重程度存在显著性差异(P<0.01)；携带L等位基因的冠脉病变程度显著较P等位基因的严重(P<0.01)。

表3 MEF2A-P279L基因型与冠脉病变支数的相关性

表4 MEF2A-P279L等位基因频数与冠脉病变支数的相关性

讨 论

自2003年研究发现人类肌细胞增强因子2基因的突变影响并降低了MEF2A因子的转录以及蛋白质的合成，从而对血管内皮进行破坏，促进血管内皮脂质的沉积以及血管炎性介质的聚集，最终启动了动脉粥样硬化的病理生理过程。因此，MEF2A被认为是第一个被发现的冠心病的致病基因[1]。

本研究结果显示：MEF2A-P279L基因型的分布在冠心病组和对照组存在显著性差异(P<0.01)。说明MEF2A-P279L在我国西北地区汉族人群中分布存在多态性，而且是增加冠心病易患的遗传因素。文献报道[2]：P279L等位基因在西班牙人群中存在突变情况，病例组中P279L突变基因携带者的频率明显高于对照组，在西班牙人群中该突变型可能与冠心病、心肌梗死升高的发病风险相关，这与我们的研究结果相一致。但Kajimoto等[3]以及Weng等[4]研究未发现在病例组中P279L存在缺失突变，从而提出MEF2A基因的这种变异应该是一种极罕见的多态，而不是所谓的致病缺失突变。李婧等[5]对冠心病组和对照组人群中的MEF2A基因外显子进行扫描时，未发现P279L碱基突变。这些研究结果与我们的研究结果不一致，这些差异可能与不同地域、不同种群的MEF2A基因多态性分布不同以及对冠脉病变严重程度的影响也不同。

本研究结果揭示了MEF2A-279P/L基因型在西北地区汉族人群中的分布情况、及其与冠心病和冠脉病变严重程度的关系，从基因水平对冠心病进行早期预防、早期诊断，为治疗冠心病提供新的依据。

[1] Wang Q,Fan C,Topol SE,etal.Mutation of MEF2A in an inherited disorder with features of coronary artery disease[J].Science,2003,302(5650)：1578-1581．

[2] Gonzalez P,Garcia-Castro M,Reguero JR,etal.The Pr0279Leu variant in the transcription factor MEF2A is associated with myocardial infarction[J].Med Genet,2006,43(2)：167-169.

[3] Kajimoto K，Shioji K,Tago N,etal．Assessment of MEF2A mutations in Myocardial infarction in Japanese patient[J].Circ,2005,69：1192-1195.

[4] Weng L,Kavaslar N,Ustaszewska A,etal.Lack of MEF2A mutations in coronary artery disease[J].Clin Invest,2005,115(4)：1016-1020.

[5] 李 婧,杨钧国,陈汉想,等.冠状动脉粥样硬化性心脏病新致病基因MEF2A第7外显子突变的检测[J].中国临床康复杂志,2006,10(24)：72-74.

(收稿：2014-09-16)

Association of MEF2A-P279L single nucleotide polymorphism (SNP) with CHD

The Central Hospital of Xi’an (Xi’an 710003)

Zhang Tao Mu Yudong Ma Qianfeng

Objectives：To investigate the relationship between the distribution of Myocyte enhancer factor 2A (MEF2A) gene P279L polymorphism and CHD in Han nationality in Chinese North -Western area. Methods：Three hundred and eighty five Han ethnic subjects .DNA was extracted by proteinase K digestion , phenol and chloroform extraction as well as isopropanol precipitation. The polymerase chain reaction(PCR)-restriction fragment length polymorphisms (RFLP) in conjunction with sequencing were employed to test the single nucleotide polymorphisms (SNPs) in Myocyte enhancer factor 2A (MEF2A). Results：Lallelic frequency was significantly higher that in CHD group than that in control group,CHD group 16.53%，control group 5.48% (P<0.01)，Lallele was related with more severity of atherosclerosis in the coronary artery than P allele(P<0.01).Conclusion：There is significantly statistical difference of distribution frequency and severity of atherosclerosis in the coronary artery of three genotypes of MEF2A-P279L polymorphism in CHD and control group, but also L allele is related with more morbility of CHD and severity of atherosclerosis in the coronary artery.

Coronary disease Gene expression @MEF2A-P279L

*西安市科技计划基金项目(2011HM1115)

△陕西省肿瘤医院检验科

冠状动脉疾病 基因表达 @肌细胞增强因子2A基因

R589.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.011