脑清通混悬颗粒对高血压模型大鼠ET、AngⅡ、CGRP的影响*

2015-03-22周海哲李香李军

陕西中医 2015年3期

关键词：灌胃高血压病造模

周海哲李香李军

陕西中医学院( 咸阳 712046)

脑清通混悬颗粒对高血压模型大鼠ET、AngⅡ、CGRP的影响*

周海哲李香△李军

陕西中医学院( 咸阳 712046)

目的：探讨脑清通混悬颗粒对血压及内皮素(ET)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、降钙素基因相关肽(CGRP)的影响。方法：将70只同批、同饲养条件成年SD大鼠随机分为空白组10只，造模组60只。造模组给予慢性复合应激进行高血压造模14d，自复合刺激造模第2周起同时配合高脂乳剂灌胃法进行肝热痰瘀证型造模，连续高脂乳剂灌胃10d。将造模成功的大鼠选取50只，随机分为高血压模型组，脑清通混悬颗粒大、中、小剂量组及卡托普利药物对照组。分别给予相应量的生理盐水、脑清通混悬颗粒大、中、小剂量和卡托普利溶液灌胃3w，观察其对大鼠血压、ET、AngⅡ、CGRP的变化，以及胸主动脉血管壁形态的影响。结果：脑清通混悬颗粒各剂量组均可有效的抑制大鼠血压升高趋势，但降压作用以第3周为著，治疗前、后及其与模型组比较有显著性差异(P<0.01或P<0.05)；脑清通混悬颗粒各剂量组与模型组比较ET、AngⅡ含量降低，CGRP含量升高，具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)；光镜下结果：模型组血管壁内膜水肿，胶原纤维增生，管壁脂质细胞增多甚或附有斑块，平滑肌组织增生；脑清通混悬颗粒大、中剂量组较模型组内膜相对光滑，局部有少量脂质细胞粘附，胶原纤维、平滑肌组织增生不明显，明显好于模型组。结论：脑清通混悬颗粒治疗肝热痰瘀型高血压大鼠作用的机理可能是通过对血清ET、CGRP、AngⅡ的调节，起到保护血管内皮功能的作用，而血管内皮功能得到改善则血压可相应的下降。

高血压病是心、脑血管疾病的重要病因与危险因素，影响心、脑、肾等重要脏器的结构和功能，最终导致这些器官功能的衰竭，至今仍是心脑血管疾病的主要死亡原因之一。高血压病对人类的生命健康构成严重威胁，但目前国内外尚无根治的方法。随着近年来对血管壁内皮细胞生成、激活、释放的血管活性肽认识的不断深入，在细胞分子学领域，对高血压病的认识有了新的进展。脑清通混悬颗粒是中药复方制剂，具有清肝活血、涤痰通络之效。本实验通过对肝热痰瘀型高血压模型大鼠应用脑清通混悬颗粒前、后的血压及ET、AngⅡ、CGRP及血管壁形态变化，来初步分析其治疗高血压病的作用机理。

1 材料 1.1 药物复方脑清通混悬颗粒：将草决明、丹参、姜半夏、野菊花等按一定比例配伍组成，分别用醇提水沉法提取、浓缩、干燥、制粒，制成颗粒剂，由陕西中医学院第一附属医院制剂中心提供，批号120710。

1.2 实验动物同批、同饲养条件成年SD大鼠70只，雌雄各半，体重180～220g，动物合格证号：医动字第07―001号，一级；由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.3 高脂饲料的制备[1]按照胆固醇10g，猪油20g，牛磺胆酸钠2g，4-甲基硫氧嘧啶1g，吐温-80 20 mL，丙二醇30mL，蒸馏水加至100 mL的比例配制。首先将猪油加热熔化，然后加入胆固醇进行搅拌，使其熔化后，再加入牛磺胆酸钠及甲基硫氧嘧啶，充分搅匀后，再放入丙二醇、吐温-80及蒸馏水，将其不断搅拌，等制备的高脂乳剂全部熔化后，再将其冷却至室温，置入冰箱内4℃保存。使用时置于37℃的水浴中熔化。

1.4 实验仪器 RBP-1B型无创大鼠血压测定仪(由北京中日友好临床医学研究所生产)；便携式音箱，大鼠固定台，一次性注射器，小血管钳，灌胃用钝头针头，医用一次性无菌手套，肝素抗凝管，电子天平等。

2 方法 2.1 造模及分组 2.1.1 造模:参照王秀卿等[2]慢性复合应激性高血压大鼠模型的建立方法，实验大鼠适应性喂养1w后，首先从70只实验大鼠中随机抽出10只来作为空白组(A组)，其余60只随机分为B、C、D、E、F组，每组12只，以用作慢性复合应激的造模。分组后以RBP-1B型无创大鼠血压测定仪测量每只大鼠的基础血压，连续量3次，取其平均数作为大鼠造模前的血压值。自实验第2周起，造模(B、C、D、E、F)组大鼠分别放在RBP-1B型无创大鼠血压测定仪自带的电刺激箱中，以低压、低频交流电电击造模组大鼠足底且结合100dB的噪音进行同步刺激。刺激的电源强度以对大鼠不造成损伤，但引起其强烈反应为准。具体操作方法如下：造模(B、C、D、E、F)组大鼠于每天的上午9∶00～11∶00时及下午3∶00～5∶00时各接受应激刺激，总共电刺激14d。第1周：大鼠电刺激强度为40V[2、3]，刺激频率为2Hz，且结合100dB的噪音进行同步刺激。每次于电刺激箱中放入3只大鼠进行电刺激，造模组60只大鼠总共分20批，每隔40min刺激2min，持续2.00 h，即上、下午每只大鼠各刺激3次；第2周：电刺激强度50V[2、3]，大鼠电刺激的频率、刺激持续的时间和噪音分贝同前，同步刺激，上下午分别进行。大鼠进行刺激的过程中，噪音源置放于电刺激箱的外面，不与大鼠直接产生接触。

制备的高脂乳剂按照1mL/100g的标准，在慢性复合应激造模过程的第8天起，造模组大鼠在复合刺激的基础上开始给予高脂乳剂灌胃，连续10d[4]。

2.1.2 高血压大鼠造模成功判定标准:参照王秀卿等的应激性高血压判定标准，造模2周后测量大鼠的平均收缩压(SBP)，造模后大鼠血压与造模前大鼠血压的差值升高大于或等于20mmHg(1mmHg=0.133kPa)[2]，并且高于115mmHg[5]者，即可以确定为高血压疾病造模成功。

2.1.3 实验动物分组:实验慢性复合刺激造模的第8天，造模组中一只大鼠在相互厮打中被咬死，复合刺激造模的第14天(高脂灌胃第7天)，造模组一只大鼠发生急性脑梗塞，其右侧肢体活动不遂，发病第2日即死亡。造模组存活的大鼠中有5只高血压造模不达标，另有3只大鼠肝热痰瘀症状不达标，造模组大鼠符合造模成功标准的共50只。再次将肝热痰瘀型高血压造模成功的大鼠随机分为模型组、西药组、中药大、中、小剂量组各10只。

2.1.4 给药及喂养方式:自实验第25天起各实验组大鼠均开始给予灌胃给药，1次/d，均在下午进行。每只动物按体重计算用量(1mL/100g)。空白组和模型组大鼠灌0.9%生理盐水，西药组灌卡托普利溶液(0.335mg/mL[6])，中药组灌脑清通颗粒混悬液，大、中、小剂量的配制分别为1.03g/mL，0.69g/mL， 0.34g/mL[6]，疗程为3周。实验期间，各组大鼠均自由饮水。

2.2 标本采集及指标检测 2.2.1 血压测量：采用大鼠无创尾动脉测压法。

2.2.1.1 慢性复合应激造模期间大鼠血压的测量:于实验的前3天使所有大鼠均适应测量血压的过程。在施以应激刺激的前1天和应激刺激的第4、8、11天及复合应激结束后1d，用无创大鼠尾动脉测压仪测量实验大鼠的血压。每次测量均在同一时间(上午11：00时) 测量大鼠血压。每次测量时将4只清醒大鼠置于固定笼中，放入RBP-1B型大鼠无创血压测量系统内，使鼠尾穿过尾套，尾套和换能器相连接，36℃预热至10～15min，待大鼠尾动脉充分扩张后，将尾套加压，直至脉搏信号完全消失后，再缓慢放气至其脉搏信号恢复正常。应用RBP-1B型大鼠无创血压测量系统自带软件，可以测量大鼠实时收缩压，连续测量3次，取其平均值。

2.2.1.2 药物灌胃期间大鼠血压的测量:每周测一次，每次亦均在同一时间(上午11：00时)测量大鼠血压。具体测量血压的方法同前。

2.2.2 取血:药物灌胃的第3周末，最后一次灌胃给药后予6h禁食，不禁水。大鼠均在麻醉的状态下进行实验。以10%的水合氯醛，按3mL/100g (300mg/Kg)[7]剂量标准行大鼠腹腔注射麻醉，将实验大鼠仰卧位置于操作台，使大鼠身体保持自然状态，胸廓不要扭曲，在胸部左侧行切口剪开皮肤，分离其胸部的脏器，暴露出心脏，用10mL一次性注射器针管配一次性6号注射器针头，取其右心室血液，每只大鼠取血大约8 m1，将其中2mL血液沿管壁缓慢注入至含有20μL的0.30M EDTA(乙二胺四乙酸铁钠)、20μL的0.34M8-羟基喹啉硫酸盐和10μL的0.32M二巯基丙醇的抗凝试管中，迅速摇匀后，4℃低温下离心(3000r/min)15min，然后取上清以备用，-20℃保存以测定AngII。另取2mL的血液迅速置于含有30μL的7.5% EDTANa2和40μL的抑肽酶试管中，将其摇匀后，放入冷水浴中进行冷却。离心时，混匀低温离心4.0℃(3000rpm )，离心5min，分离出血浆后，取其上清液置放于聚丙乙烯塑料试管内，以测定ET-1、CGRP。

2.2.3 制备病理切片:大鼠取血完毕后，迅速分离、切取其胸主动脉，取近段(近心脏段)的主动脉5mm，以10%的中性福尔马林液进行固定之后石蜡包埋，切片厚度为4um，并同时对每份切片进行标记。

2.2.4 病理检测:常规HE染色，电子光镜下观察主动脉管壁内膜及中膜的形态变化。

2.3 统计学处理实验数据的分析采用SPSS17.0统计软件。成组设计多个样本均数进行比较时采用单因素方差统计分析，进行组间比较时应用t检验，数据检验水准P<0.05时为有统计学意义。

3 实验结果与分析 3.1 大鼠血压的检测结果值 3.1.1 复合应激造模期间大鼠血压

表1 复合应激造模期间大鼠血压值(±s)

注：大鼠正常血压，不麻醉，收缩压93(82-120)mmHg。与复合应激造模前比较▲P<0.01，△P<0.05；与空白组比较◆P<0.05，◇P<0.01

从表1可看出大鼠血压变化：应激前大鼠平均收缩压为90mmHg左右，应激过程的第4 d造模组大鼠血压明显上升，基本为110 mmHg左右，至第8天明显上升至124 mmHg左右，第11日及第15日虽较前略有上升，但基本趋于平稳,提示已发展为应激性高血压。空白组大鼠血压未见明显变化。

3.1.2 脑清通混悬颗粒对高血压大鼠血压影响

表2 脑清通混悬颗粒对高血压大鼠血压影响的变化(±s/mmHg)

注：与治疗前比较△P<0.05，▲P<0.01；与模型组比较◆P<0.05，◇P<0.01

从表2可以看出：脑清通混悬颗粒各剂量组均具有抑制大鼠血压升高的趋势。灌胃给药2周后，脑清通混悬颗粒各剂量组均产生明显的降压效果，与治疗前及模型组比较，具有显著差异(P<0.01或P<0.05)，且降压效果于给药第3周后达到高峰。

3.2 大鼠血管活性肽的检测结果

表3 脑清通混悬颗粒对高血压大鼠血管活性肽的影响

注：与空白组比较▲P<0.01，△P<0.05；与模型组比较◆P<0.05，◇P<0.01

从表2可以看出：模型组、西药组及中药各剂量组内皮素、血管紧张素Ⅱ含量均明显高于空白组，而降钙素基因相关肽含量均明显低于空白组，有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，说明了高血压大鼠存在血管壁内皮的受损导致其分泌及释放血管活性多肽的功能紊乱，进而造成血管舒-缩功能的失衡，血压升高的病理；而中药各剂量组较模型组内皮素、血管紧张素Ⅱ含量降低，降钙素基因相关肽含量升高，具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，说明脑清通混悬颗粒具有调节血管舒-缩活性多肽各指标水平，保护血管内皮功能以达到间接降低血压的作用。

3.3 大鼠胸主动脉光镜下观察结果由以下各组图片可以看出：空白组主动脉血管内膜光滑，内膜为疏松纤维结缔组织，管壁内皮细胞排列整齐有序，未见异常改变。模型组血管壁内膜水肿，胶原纤维、平滑肌组织增生，并见有脂纹，甚至有的出现混合斑块，均提示实验大鼠在高血压病的基础上以出现了动脉粥样硬化。西药组及中药各剂量组经药物灌胃干预后其血管壁均有不同程度地改善，但中药大、中剂量组血管壁的改变最明显。证明脑清通混悬颗粒可以改善血管弹性，保护血管内皮，具有抗动脉粥样硬化的作用,见图1。

4 讨论高血压病是严重危害人类身体健康的流行病之一，在全球都有很高的发病率，且高血压是心脑血管疾病最重要的危险因素。现在越来越多的研究资料显示，目前高血压病患者多存在着血管舒缩功能的调节异常，而血管活性多肽对血管舒缩功能的调节起着非常重要的作用。高血压病与血管管壁硬化致血管舒缩功能受限程度呈线性相关，而引起血管壁弹性减退的因素当中，血管活性多肽的调节血管舒-缩功能失常而引起的心血管重塑作用，成为促发高血压病及动脉粥样硬化等心血管疾病的发生与进展的重要因素[8，9]。

ET-1广泛地存在于机体各种组织与细胞内，为一内源性长效的血管收缩调节因子，其具有非常强大的正性肌力作用，是至今为止发现的效力最强的血管收缩调节因子。且有研究发现，ET的升高和患者的血压水平以及其靶器官受损的程度呈正相关，提示了ET不仅参与高血压病的启动步骤，亦在高血压病的维持及并发症的发生中起着非常重要的作用。AngⅡ为RAAS中最强的血管活性物质，具有非常强烈的收缩血管的作用，直接使动脉平滑肌产生收缩，增加外周阻力。AngⅡ能增加交感神经冲动的发放，增加醛固酮的分泌，加强体内的水钠潴留。AngⅡ还可促进血管内皮细胞与VSMC的肥大、增殖，进而促进动脉粥样硬化的发展，导致血管壁的重塑，增加血管阻力，甚至发展为左心室肥厚等，在整个高血压病的发生与发展的过程中起着非常重要的作用。CGRP广泛地分布在心血管系统中，为机体中作用最为强烈而持久的舒血管活性多肽。临床及实验研究中发现的原发性高血压病者和自发性高血压大鼠的血浆中CGRP浓度的降低，被作为血压升高的重要原因。而在继发性的高血压病者(例如醛固酮增多症)以及两肾一夹型高血压大鼠血浆中的CGRP浓度的增高，被认为机体为了抵抗血压的升高作出的有益代偿。外源性给予CGRP亦可以降低血压。CGRP能够强烈地舒张血管，使血压降低，增加机体的血流量，抑制血小板的凝集，抑制VSMC的增殖等以对抗组织的损伤，起到保护血管壁内皮细胞的重要作用。

图1 大鼠胸主动脉光镜下观察结果

高血压病属于中医学的“眩晕”、“头痛”范畴，其基本病机为肝肾阴虚，肝阳上亢，痰瘀内阻。现在大量研究资料提示高血压病不同分型的患者中其血管活性肽水平亦有明显区别，并将血管内皮功能损伤视为肝肾阴虚证的病理生理基础[10]。脑清通混悬颗粒由草决明、丹参、姜半夏等药物组成，具有平肝潜阳、化痰通络之功效。根据中药药理分析，草决明具有显著地降低血压、抗动脉粥样硬化、改善脑部血液供应及镇静的作用，且其还可以调节机体胆固醇水平，保护血管内皮，改善血管弹性的作用。丹参有效成分可以扩张冠脉血管，降低血压，提高冠脉血流量；亦可以改善血液流变性，降低血浆粘度，抗血小板凝集；此外，其还可以调节血脂，抗动脉粥样硬化。姜半夏具有显著地镇咳，且其还可降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白而具有调节血脂的作用。本文以血压、ET、CGRP、AngⅡ作为观察指标，探讨脑清通混悬颗粒对上述指标的影响。

通过实验证明脑清通混悬颗粒对高血压模型大鼠的血压、ET、CGRP、AngⅡ均有明显改善，且其作用明显优于卡托普利组。说明脑清通混悬颗粒大、中、小三个剂量均有降低血压及调节血管活性肽水平以维持整个血管张力控制系统稳定的作用，且中剂量为最佳剂量，建议临床应用。

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(收稿2014-10-11；修回2014-11-08)