间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测结果分析

西安市第五医院检验科(西安710082)

王梦涛 赵婵媛 刘小玲 卢春利 王 锐

间接免疫荧光法与线性免疫印迹法对自身抗体检测结果分析

西安市第五医院检验科(西安710082)

王梦涛 赵婵媛 刘小玲 卢春利 王 锐

目的：探讨自身特异性抗体筛查试验间接免疫荧光法(IIF)与确认试验线性免疫印迹法(LIA)检测结果的相关性。方法：用IIF法作为抗核抗体(ANA)的筛查试验，用LIA法作为抗核抗体谱(ANAs)特异性抗体的确认试验，对自身免疫性疾病组(AID)及非AID疾病对照组进行检测分析，并将检测结果分为四组：IIF-ANA+/LIA+组，IIF-ANA+/LIA-组，IIF-ANA-/LIA+组和IIF-ANA-/LIA-组。结果：①在611例AID组中，IIF-ANA+/LIA+ 336例(55%)，IIF-ANA+/LIA-116例(19%)，IF-ANA-/LIA+ 55例(9%)，IIF-ANA-/LIA- 104例(17%)。②在100例非AID组中，IIF-ANA+/LIA+ 2例(2%)，IIF-ANA+/LIA- 7例(7%)，IIF-ANA-/LIA+3例(3%)，IIF-ANA-/LIA- 88例(88%)，总体符合率90%。AID组与非AID组自身抗体的检测结果比较差异有统计学意义。 ③ IIF-ANA-/LIA+组中，以抗SSA抗体、抗Ro-52抗体、抗ds-DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗Jo-1抗体为主要检测出的阳性自身抗体。AID组IIF-ANA+/LIA-中，ANA检测核型以均质型、斑点型为主，混合核型以均质斑点型为主，荧光检测滴度以1∶40～1∶320为主；非AID组IIF-ANA+/LIA-中，核型以斑点型为主，荧光滴度以1∶40～1∶320为主。结论：AID患者可能会出现IIF-ANA检测阳性而LIA-ANAs检测阴性或者IIF-ANA检测阴性而LIA-ANAs检测阳性，检查除了进行IIF筛查ANA外，还需进行自身抗体谱的特异性抗体确认实验。

自身抗体检测对于自身免疫性疾病(Autoimmune disease，AID)的诊断和鉴别诊断具有重要意义，用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence，IIF)检测抗核抗体(Antinuclear antibody ，ANA)是目前应用最广泛的自身抗体筛查指标，IIF法检测ANA作为初筛试验，虽然不具有疾病特异性，但由于其测定是针对细胞成分的总抗体，检测敏感性高，对疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义[1]。目前国内有些实验室在IIF-ANA检测结果阴性的情况下，就不再进行ANA谱特异性抗体的确认试验检测，只有ANA检测结果阳性，才进行ANA谱特异性抗体的测定[2]。还有一些实验室只进行ANA谱特异性抗体检测而不检测ANA，但在实际工作中，IIF检测ANA结果与LIA法检测特异性自身抗体结果常不完全符合。我们实验室对611例AID患者血清抗体同时采用IIF法检测ANA，LIA法检测12种特异性自身抗体，比较两种检测方法结果的符合情况，探讨两种方法检测结果的相关性以及是否可以作为相互补充，以提高检测灵敏度的联合检测手段。

资料与方法

1 一般资料 收集2013年8月至2014年8月在我院确诊为AID的住院患者标本共计611例，其中男性151例，年龄6～79岁，女性460例，年龄2～88岁。所有标本同时采用IIF法检测ANA和LIA法检测针对12种自身抗原(RNP/Sm、Sm、SSA、Ro-52、SSB、Scl-70、Jo-1、CENP B、双链DNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白)的自身抗体。同时收集确诊为其它疾病的非AID患者100例作为对照，其中男性41例，年龄6～78岁，女性59例，年龄5～82岁。所有AID患者的诊断均符合国际相关学会的诊断指南，标本均为待测患者清晨空腹静脉血，离心分离冷冻保存的新鲜血清。

2 检测方法

2.1 用IIF法检测ANA:采用美国SCIMEDX公司提供的ANA检测试剂盒，以人喉癌上皮细胞(HEp-2)为抗原基质，用间接免疫荧光法(IIF)检测，然后在荧光显微镜下观察荧光模型，抗体滴度≥1:40为阳性。

2.2 用LIA法检测ANAs：采用Euroimmun公司提供的LIA法检测12种特异性自身抗体试剂盒，检测抗RNP/Sm抗体、抗Sm抗体、抗SSA抗体、抗Ro-52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体、抗Jo-1抗体、抗CENP B抗体、抗双链DNA抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体、抗核糖体P蛋白抗体，实验完全按照操作说明书操作。

3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件，IIF法ANA检测阳性而LIA法ANAs检测阴性( IIF-ANA+/LIA-) 组、IIF法ANA检测阴性而LIA法ANAs检测阳性(IIF-ANA-/LIA+)组以及IIF法检测ANA滴度组间不同疾病患者比例的比较均采用X2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 在611例AID组患者中ANA与ANAs检测结果总体符合率为72%，两者同时阳性所占的比例为55%，远高于两者同时阴性的17%，两者差异有统计学意义(χ2=124.5，P<0.01)。在AID组和非AID组中两种检测方法同时阳性所占的比例分别为55%和2%，差异有统计学意义(χ2=215.5，P<0.01)，两组ANA检测阳性而ANAs检测阴性所占比例分别为19%和7%，差异有统计学意义(χ2=25.13，P<0.01)，两组ANA检测阴性且ANAs检测阳性所占比例分别为9%和3%，差异也有统计学意义(χ2=14.85，P<0.01)。AID组与非AID组IIF法检测ANA和LIA法检测ANAs的结果总体分布，见表1、表2。

表1 AID组中IIF法检测ANA和LIA法检测ANAs的总体分布

2 在AID组及非AID组中ANA检测阴性且ANAs检测阳性者所检测出的主要自身抗体为抗SSA抗体、抗Ro-52抗体，其次抗Sm抗体、抗SSB抗体、抗ds-DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗Jo-1抗体、抗Scl-70抗体也有一定的阳性率。58例IIF-ANA检测阴性且LIA-ANAs检测阳性患者中，AID组与非AID组比较，自身抗体的阳性率有统计学意义(P<0.01)，两组里抗SSA抗体和抗Ro-52抗体与其它自身抗体的差异也有统计学意义(P<0.01)，见表3。同时，我们所检测的AID组中IIF-ANA+/LIA-组里的荧光模型以细胞核斑点型及均质型为主，而非AID组则以细胞核斑点型为主。在123例ANA检测阳性且ANAs检测阴性者中，AID组以斑点型和均质型为主，明显高于非AID组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表2 非AID组中IIF法检测ANA和LIA法检测ANAs的总体分布

3 对IIF-ANA+/LIA-组滴度的测定：AID组荧光检测滴度以1∶40～1∶320为主，非AID组荧光滴度也以1∶40～1∶320为主。相比较AID组在1∶40～1∶80，1∶160～1∶320各组中所占比例与非AID组均接近，差异没有统计学意义(P>0.05)，见表5。

表3 AID组及非AID组ANA阴性而ANAs阳性者中自身抗体阳性的分布情况

表4 AID组及非AID组ANA阳性而ANAs阴性者中荧光模型分布情况

注：S为斑点型，H为均质型，N为核仁型，SH为斑点均质混合型，Cyto为胞浆颗粒型

表5 ANA阳性ANAs阴性组滴度测定在AID组与非AID组中的比较

讨 论

自身免疫性疾病总体发病率占世界人口的3%～5%，已成为严重影响人类健康的疾病，自身抗体检测对AID诊断和鉴别诊断、病情评估与治疗监测、病程转归与预后判断等都具有重要的临床应用价值[3]。以HEp-2细胞做为基质的间接免疫荧光法检测ANA的方法，具有操作简单，敏感性高，且结果易于判读等优点，但ANA筛查对AID诊断没有特异性且该方法自动化程度较低，操作标准化较难[4]，另外同种特异性抗体可出现不同的荧光染色核型，不同特异性抗体也可出现同样的荧光染色核型[5]。当我们在AID患者中，同时进行ANA筛查及ANAs确认试验时，由于各方法的抗原所用的基质不同，抗原来源不同，化学实验反应体系不同，实验的敏感性和特异性不同，会出现ANA和ANAs检测结果不一致的现象，有两种情况需要注意：一种是IIF法检测ANA阳性而LIA法检测ANAs阴性的情况，这是因为ANA筛查实验具有覆盖ANA抗体面广的特点，其抗体针对细胞中的所有抗原成分，而ANAs所检测的特异性抗体对疾病的检测具有较高的特异性，但目前免疫学所能检测的特异性抗体仅为自身抗体中的一小部分，仍有大量的未知特异性自身抗体未被认识或未应用于临床检测[6]，也就是说确认实验检测的是一些最常见的、临床意义已经明确的自身抗体，对于某些少见的、未知的抗体则只能通过荧光方法来检测，而这些少见或未知抗体对疾病诊断也可能有一定的提示意义。另外由于检测时的干扰现象或人体正常免疫反应，以及一些非特异性的抗原会造成荧光检测的阳性，在部分正常人血清检测ANA时会出现一定比例的阳性(5%)，但滴度比较低。还有一种情况是IIF检测ANA阴性而LIA法检测ANAs阳性的标本，这主要是由于HEp-2细胞基质中某些靶抗原的分布不均[7]，表达含量低(如RO-52、SSA、JO-1等)，以及不同固定方法对相关抗原的影响，细胞处理时的某些抗原位点缺失等，这些均可能造成荧光检测的阴性，或者如果ANA谱分离的抗原不纯，转运过去的抗原也可能不纯，造成多余条带，导致假阳性的出现。

在临床实际工作中，由于认识的误区、局限性及考虑检测成本的因素，许多实验室仅对IIF法检测ANA阳性的标本才做进一步的ANAs特异性抗体确认试验，或者只做ANAs确认试验而不做筛查ANA的检测，本文通过相关的结果分析显示两种方法检测的总体符合率为72%，经统计学分析，两种方法的检测结果差异有统计学意义，若只对ANA检测阳性的患者再进一步做ANAs的确认试验，则会有近9%左右的漏检率，同样，若只做特异性抗体的确认试验不做ANA筛查，也会有将近19%左右的患者漏检。由此表明，在自身抗体的筛查试验为阴性的患者中，仍然存在经确认试验检测证实为阳性的患者，同时也会出现筛查试验阳性而确认试验阴性的情况，为了避免漏检应同时结合各种检查结果，并进行结果的综合考虑，两者不能互相替代。

综上所述，对于疑似自身免疫性疾病的患者，无论IIF法ANA检测初筛试验阳性与否，均需进行针对特异性抗体的确认试验检测，两种方法配合临床诊断，将最大限度的减少自身免疫性疾病患者的漏检率，从而争取最佳治疗时间。

[1] Pelerson LK，Wells D，Shaw L，etal.Novel method for quantitatine ANA measurement using near-infrared imaging[J].Immunol Methods，2009，349:1-8.

[2] Hahm D，Anderer U. Establishment of HEp-2 cell preparation for automated analysis of ANA fluorescence pattem[J]. Cytometry A，2006，69(3):178-181.

[3] Li Yongzhe.The problems of clinical application and quality assurance in the clinical application and quality assurance of self antibody detection tec-hnology[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine，2006，(9):769-773.

[4] Sack U，Conrad K，Caemok E，etal. Autoantibody detection using indirenct immunofluorescence on HEp-2 cells[J].Ann NY Acad Sci，2009，1173:166-173.

[5] LiZheng，ChenJie，YuanWenjuan etal. Karyotype distribution of antinuclear antibodies and its correlation with specific antibody[J].Labeled Immunoassays and Clinical Medicine，2013，20(6)，433-435.

[6] Damoiseaux JG，Tervaert JW.From ANA to ENA:How to proceed[J].Autoimmun Rev，2006，5:10-17.

[7] Bossuyt X，Luychx A.Antidodies to extractable nuclear antigens in antinuclear anybody-negative samples[J].Clin Chem，2005，51(12):2426-2427.

(收稿：2015-05-08)

Analysis of autoantibodies detection between indirect immunofluorescence method and linear western blot method The Fifth Hospital of Xi’an，Department of Laboratory Medicine

(Xi’an 710082)

Wang Mengtao Zhao Chanyuan Liu Xiaoling et al

Objective: To explore the correlation of the specific antibody results between screening test of IIF and validation test of LIA. Methods: IIF method as ANA screening test，using LIA method as the validation test of ANAs ，Analysis the group of AID and the disease control group of not AID，the test results can be divided into four groups: group IIF ANA + / LIA +，group IIF ANA + / LIA -，group IIF - ANA - / LIA +，group IIF - ANA - / LIA - . Results:①In 611 cases of AID groups：IIF ANA + / LIA + had 336 patients (55%)，IIF ANA + / LIA - had 116 patients (19%)，IIF ANA - / LIA + had 55 cases (9%)，IIF ANA - / LIA - had 104 patients (17%) . ②In 100 cases of the not AID group: IIF ANA + / LIA + had 2 cases (2%)，IIF ANA + / LIA - had 7 cases (7%)，IIF ANA - / LIA + had 3 cases (3%)，IIF ANA - / LIA - have 88 patients (88%)，the overall coincidence rate was 90%. Two groups autoantibodies detection results had significant statistical significance difference . ③In the IIF ANA - / LIA + group，there are anti SSA antibody，anti Ro-52 antibody，anti ds-DNA antibody，antihistonesantibody，anti Jo-1 antibody as main detected positive autoantibodies. In the AID groups of IIF ANA + / LIA -，ANA detection karyotype was given priority to with homogeneous，spots，and mixed karyotype was given priority to with homogeneous spots type，and the fluorescence detection of antibody titer was given priority to with 1∶40～1∶320; In the not AID group IIF ANA + / LIA -，karyotype was given priority to with spot type，the fluorescence detection of antibody titer was given priority to with 1∶40～1∶320. Conclusion: In the clinical test of AID may appear the IIF test positive for the ANA and LIA -ANAs test negative or IIF - ANA test negative and LIA-ANAs test positive.So in the clinical test of AID，in addition to the IIF screening test，you also need to do the confirmation experiment of autoantibodies spectrum simultaneously，so as to avoid a misdiagnosis because ofthe single test.

Autoantibodies Fluorescent antibody technique,indirect Antibodies,antinuclear Immunoblotting Fluorometry

自身抗体 荧光抗体技术，间接 抗体，抗核 免疫印迹法

R446.6

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.046