miR-300在浆液性卵巢癌患者血清中的表达及其临床意义

陕西省肿瘤医院妇瘤科(西安710061)

袁 渊 姚安梅 周 敏 王 静

·临床研究·

miR-300在浆液性卵巢癌患者血清中的表达及其临床意义

陕西省肿瘤医院妇瘤科(西安710061)

袁 渊 姚安梅 周 敏 王 静

目的:探讨miR-300在浆液性卵巢癌患者血清中的表达及其临床意义。方法:收集卵巢癌患者、良性卵巢肿瘤患者及健康妇女各57例的血清标本，提取血清总RNA，通过实时定量PCR检测血清miR-300的表达水平，并绘制ROC曲线；采用χ2检验miR-300的表达水平与卵巢癌患者临床病理特征的关系，Kaplan-Meier法分析患者5年总体生存率之间的关系。结果: 卵巢癌患者血清中miR-300的表达水平显著高于良性卵巢肿瘤患者及健康对照患者，miR-300 ROC曲线下面积0.812 (95%CI:0.761-0.911)，灵敏度为84.6%，特异度为85.3%。血清miR-300的表达水平与浆液性卵巢癌患者的临床分期密切相关(P=0.0018)，而与年龄(P=0.792)及淋巴结分期(P=0.793)无显著相关性。血清miR-300高表达的卵巢癌患者5年总体生存率要显著低于血清miR-300低表达患者。结论: 浆液性卵巢癌患者血清中miR-300表达水平增高，为浆液性卵巢癌的临床诊断及预后判断提供了重要参考。

卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤，在女性常见恶性肿瘤中占2.4%～6.5%，在女性生殖系统癌中次于宫颈癌和宫体癌。卵巢癌的病因尚不清楚，可能与年龄、生育、血型、精神因素及环境等有关，此外，卵巢癌发病隐匿，早期可无症状，晚期常有腹胀、腹大或下腹部包块、或包块长大迅速，发现时患者常处于晚期已失去手术机会，往往病程短，病死率高，严重威胁着妇女的健康和生命[1]。因此，提高卵巢癌的早期诊断率，给予合理的早期治疗，对于提高患者生存质量、降低患者病死率有重要的临床意义。

MicroRNA (miRNA)是一类进化上保守的非编码小分子RNA，具有在翻译水平调控基因表达的功能。研究表明miRNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。此外，新的研究结果显示miRNA在血清中稳定表达,肿瘤患者血清中的miRNA可以作为肿瘤诊断的标志物[2-3]。本研究我们将检测浆液性卵巢癌患者血清中miR-300的表达情况并分析其诊断及判断预后的价值。

材料与方法

1 材 料 收集2007年6月至2010年6月期间陕西省肿瘤医院收治的57例浆液性卵巢癌患者、57例良性卵巢肿瘤患者、57例健康体检者的血清标本，受试者的临床资料完整，并自愿签订了知情同意书。病例纳入标准:①患者均经影像学和病理组织学确诊为浆液性卵巢癌，均为初诊初治患者；②均未接受放、化疗及激素等药物治疗；③肝肾功能未见异常；④无其他肿瘤及内科疾病。术后每3个月进行一次随访，随访截止之间为2015年6月。实验组浆液性卵巢癌患者年龄28～70岁，其中I-II期23例，III-IV期34例，高分化27例，中/低分化30例；健康对照组年龄27～75岁；良性卵巢肿瘤患者组年龄25～74岁。三组受试者在年龄、生理等一般资料方面比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。空腹采血5ml，真空干燥管中保存，2000r/min，10min 后，-80℃冰箱保存备用。

2 miR-300的提取及反转录 按照北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒所述步骤提取miRNA。紫外分光仪检测RNA浓度及纯度。应用TaKaRa公司的特异性miRNA反转录引物并按照反转录试剂盒步骤合成cDNA，每个反转录体系中含有10 ng 的RNA模板。反转录的条件: 15℃ 20 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。

3 RT-qPCR 反应条件：95℃ 10s，95℃20 s，62℃ 40s，40个循环。采用的相对定量法计算miR-300的相对表达量(F)，F = 2-△ct，△ct =ctmiR-300-ctU6，其中ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

4 血清CA125含量检测 使用全自动化学发光分析系统的AXSYM生化分析仪及配套CA125检测试剂对血清 CA125 进行检测，参考值为0～35 U/ml。

结 果

1 miR-300在浆液性卵巢癌患者血清、良性卵巢肿瘤患者血清、和健康对照血清中的表达水平差异 通过RT-qPCR检测浆液性卵巢癌患者血清、良性卵巢肿瘤患者血清、和健康对照血清中miR-300 的表达水平，结果显示浆液性卵巢癌患者血清中miR-300的表达水平显著高于良性卵巢肿瘤患者及健康对照患者，差异有统计学意义(浆液性卵巢癌组vs良性卵巢肿瘤组：P<0.001；浆液性卵巢癌组vs健康对照组：P<0.001)，而在良性卵巢肿瘤患者与健康对照组血清中miR-300的表达比较差异无统计学意义(良性卵巢肿瘤组vs健康对照组：P=0.069)，如图1。

图1 浆液性卵巢癌患者、良性卵巢肿瘤患者及健康对照血清中miR-300的表达水平

2 血清miR-300表达水平与浆液性卵巢癌患者临床病理特征的关系 将57例浆液性卵巢癌患者按照病例特征因素(年龄、淋巴结转移、临床分期、细胞核分化程度)进行分类，进一步分析血清miR-300相对表达量与浆液性卵巢癌患者临床特征的关系。卡方分析结果显示，血清miR-300的表达水平与浆液性卵巢癌患者的临床分期密切相关，随着浆液性卵巢癌患者临床分期的进展，血清miR-300的表达亦逐渐升高，两组间差异有统计学意义(P=0.0018)。此外，血清miR-300在浆液性卵巢癌细胞核中/低分化组的表达显著高于细胞核高分化组，两组差异有统计学意义(P=0.003)。血清miR-300的表达与浆液性卵巢癌其他临床病理特征，包括年龄、淋巴结分期均无显著相关性，组间比较差异无统计学意义(年龄>60 岁vs年龄<60岁：P=0.792；淋巴结转移组vs淋巴结无转移组：P=0.793)，见附表。

3 血清miR-300表达水平在浆液性卵巢癌中的诊断效率 根据上述血清miR-300的表达水平，建立miR-300和CA125的ROC曲线，利用ROC曲线评价两者在卵巢癌中的诊断价值。结果显示，miR-300 ROC曲线下面积0.812 (95%CI:0.761-0.911)，灵敏度为84.6%，特异度为85.3%； CA125ROC曲线下面积为0.849 (95%CI:0.764-0.927)，灵敏度为92.9%，特异度为84.2%，如图2。血清miR-300和CA125均具有较好的诊断价值。

附表 血清miR-300表达与患者临床病理特征关系

图2 血清miR-300及CA125诊断卵巢癌ROC曲线

4 血清miR-300表达与浆液性卵巢癌患者生存之间的关系 生存分析结果显示，血清miR-300表达与浆液性卵巢癌患者术后5年总体生存率密切相关，血清miR-300高表达的浆液性卵巢癌患者术后5年总体生存率显著低于血清miR-300低表达的浆液性卵巢癌患者，差异有统计学意义(P=0.0114)，如图3。

图3 血清miR-300表达与患者术后5年总体生存率关系

讨 论

miRNA是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(18～25个核苷酸)，通过与靶基因的种子区序列相互配对抑制其基因的转录或翻译行使其功能，广泛存于真核生物体中[4]。近年来，大量研究表明，miRNA调控机体多种生理和病理过程，参与细胞的增殖、凋亡、分化、代谢等生物进程，与肿瘤的发生、发展侵袭、转移等密切相关[5]。研究发现mi RNA 在多种肿瘤组织中均有特异性的表达谱[6-7]，参与肿瘤发生、发展、转移的各个阶段，且每一个阶段都有相应的基因发生改变，同时也有调控这些基因的miRNA发生变化[8]。有研究发现循环血液中的RNA包被于一种含有外泌体、凋亡小体、微泡、凋亡微粒体的微粒中，以此可以逃避RNA酶的降解，稳定存在于循环血液中[9]。近年来，血清中游离miRNA的早期诊断价值在肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等常见肿瘤中得到了良好的验证[10-12]。因此，血清中游离miRNA被认为是有价值的肿瘤检测指标之一，能够稳定地被检测并且提示肿瘤状态，使miRNA成为新的肿瘤标志物具有良好的应用前景[13]。

miR-300是长度为22个核苷酸的非编码RNA分子，研究显示miR-300与多种肿瘤密切相关。Xu XH等人研究发现在乳腺癌中miR-300通过靶向作用于P53促进乳腺癌的增殖[14]。在骨肿瘤中miR-300表达上调，并且靶向作用于BRD7分子促进细胞的增殖及侵袭[15]。我们通过检测浆液性卵巢癌患者血清中miR-300的表达情况，发现miR-300可作为浆液性卵巢癌治疗及预后的分子指标。

[1] Ibrahim FF, Jamal R, Syafruddin SE,etal. MicroRNA-200c and microRNA-31 regulate proliferation, colony formation, migration and invasion in serous ovarian cancer [J].J Ovarian Res, 2015, 8:56.

[2] Orozco AF, Lewis DE. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma [J].Cytometry A, 2010, 77(6):502-514.

[3] Mitchell P S,Parkin R K, Kroh E M,etal. Circulating micro RNAs as stable blood-based markers for cancer detection [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105: 10513 -10518.

[4] Jiang C, Chen X, Alattar M,etal. MicroRNAs in tumorigenesis, metastasis, diagnosis and prognosis of gastric cancer [J]. Cancer Gene Ther, 2015, 22(6):291-301.

[5] Lin S, Gregory RI. MicroRNA biogenesis pathways in cancer [J].Nat Rev Cancer, 2015, 15(6):321-333.

[6] Calin CA,Croce CM.Micro RNA signatures in human cancers [J]. Nat Rev Cancer, 2006, 6:857-866.

[7] Lu J, Gerz G, Miska EA,etal.Micro RNA expression profiles classify human cancer [J]. Nature, 2005, 435:834-838.

[8] Sotiopoulou G, Pampalakis G, Lianidou E,etal. Emerging of micro RNAs as molecular switches in the integrated circuit of the cancer cell[J]. RNA, 2009, 15(8):1443-1461.

[9] Orozco AF, Lewis DE. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma [J].Cytometry A, 2010, 77(6):502-514.

[10] Xi Chen, Yi Ba, Lijia Ma,etal.Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases [J]. Cell Research, 2008, 18:997-1006.

[11] Sota Asaga, Christine Kuo, Tung Nguyen,etal. Direct serum assay for microrna-21 concentrations in early and advanced breast cancer [J]. Clinical Chemistry, 2011, 57(1): 84-91.

[12] Tsujiura M, Ichikawa D, Komatsu S,etal. Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers [J].Br J Cancer, 2010, 102(7):1174-1179.

[13] 刘宝瑞,谢 丽.miRNA:新一代肿瘤生物标志[J].临床肿瘤学杂志,2010, 15(1):1-5.

[14] Shen Z, Li C, Zhang K,etal. The up-regulation of miR-300 in gastric cancer and its effects on cells malignancy [J].Int J Clin Exp Med, 2015, 8(5):6773-83.

[15] Xue Z, Zhao J, Niu L,etal. Up-Regulation of MiR-300 promotes proliferation and invasion of osteosarcoma by targeting BRD7 [J].PLoS One, 2015, 10(5):e0127682.

(收稿：2015-07-18)

Expression and clinical significance of serum miR-300 in serous ovarian cancer patients Department of Gynecological Oncology，Shaanxi Provincial Tumor Hospital

(Xi’an 710061)

Yuan Yuan Yao Anmei Zhou Min et al

Objective:To investigate the expression and clinical significance of serum miR-300 in serous ovarian cancer patients．Methods: Collected serum samples of 57 newly diagnosed serous ovarian cancer patients，57 benign ovarian tumor patients，and 57 healthy women. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the expression of serum miR-300. Diagnostic value of serum miR-300 in serous ovarian cancer was analyzed by the receiver operating characteristic (ROC) curve. Meanwhile，the relationships between serum miR-300 expression and clinicopathological features serous ovarian cancer was analyzed by χ2 test. The association of serum miR-300 expression and 5-years overall survival of serous ovarian cancer was analyzed by Kaplan-Meier method．Results: The expression of serum miR-300 of serous ovarian cancer patients showed statistically higher than controls. The area under the ROC curve (AUC) was 0.812 (95%CI:0.761-0.911)．miR-300 screening ovarian cancer sensitivity rate was 84.6%，specificity rate was 85.3%. The serum miR-300 expression was significantly correlated with clinical stage (P=0.0018), but had no significant correlation with age(P=0.792) and lymph node staging (P=0.793). 5-year overall survival rate of patients with high serum miR-300 expression was significantly lower than patients with low serum miR-300 expression. Conclusion: The relative expression level of serum miR-300 was significantly increased in patients with ovarian cancer，which indicated serum miR-300 was a promising diagnostic and prognostic biomarker in serous ovarian cancer.

@miR-300 Ovarian neoplasms/pathology Prognosis Diagnosis

@miR-300 浆液性卵巢肿瘤/病理学 预后 诊断

R737.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.008