共焦显微镜下不同程度干眼角膜内树突状细胞观察研究*

西安市第一医院眼科(西安710002 )

朱海峰 程 燕 吴 洁 程 钰 王双勇

共焦显微镜下不同程度干眼角膜内树突状细胞观察研究*

西安市第一医院眼科(西安710002 )

朱海峰 程 燕 吴 洁 程 钰 王双勇

目的：比较不同程度干眼患者共焦显微镜下角膜内树突状细胞的密度、活化细胞比例，以期进一步揭示干眼的炎症机制，为干眼的临床诊断和治疗提供依据。方法：选择临床诊断为轻度、中度及重度干眼患者各20例，对其双眼进行共焦显微镜检查，对每幅共焦图片内角膜上皮下的树突状细胞进行计数，并换算成细胞密度(个/ mm2)。比较不同程度干眼患者的树突状细胞密度的平均值。同时对不同程度干眼共焦显微镜下活化的树突状细胞比例进行统计比较。结果：轻度干眼上皮下树突状细胞密度为26.7±8.8个/mm2，其中活化细胞比率29.0±3.7%；中度干眼树突状细胞密度为69.6±11.1个/mm2，其中活化细胞比率83.5±7.6%；重度干眼树突状细胞密度为212.2±31.0个/mm2，其中活化细胞比率97.8±1.9%。干眼患者随其严重程度增加，角膜上皮下树突状细胞密度亦呈增加趋势，并且其上皮下活化的树突状细胞比例亦增加，具有统计学差异。结论：共焦显微镜下角膜内树突状细胞是干眼炎症的重要标志之一，其密度的变化和活化细胞的比例可作为评估干眼炎症程度的有效指标。

2007年的国际干眼病专题研究报告会(DEWS)中提出干眼新的概念[1]。干眼病是泪液和眼球表面的多因素疾病，能引起不适、视觉障碍和泪膜不稳定，可能损害眼球表面。干眼病伴有泪膜渗透压增加和眼表炎症。与传统干眼定义相比较，上述概念强调了炎症在干眼发病中的重要作用。Stern等[2]将主泪腺、角膜、结膜、副泪腺和睑板腺以及泪腺之间的神经支配统称为泪腺功能单位(LFU)。众多临床研究和动物实验提示，干眼是眼表慢性的自身免疫性疾病，泪液的高渗透压触发眼表的炎症反应导致LFU失调是各型干眼发病的核心环节。眼表组织中抗原提呈细胞(APC)包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。眼表的干燥和泪液的高渗刺激角膜上皮细胞产生炎症递质如IL-1β、IL-8、TNF-α及MMP等激活未成熟的角膜树突状细胞及新的树突状细胞进入角膜组织，进而上调趋化因子和MHCⅡ的表达，这些因子的表达进一步促进APC细胞的成熟，从而触发眼表的炎症循环机制，导致炎症的发生。在干眼等炎症性疾病中，角膜树突状细胞明显增加[3]。那么其增加的程度与干眼的严重程度是否存在相关性，活化的树突状细胞比例有何变化，我们通过角膜激光共焦显微镜对其进行定量研究，为临床评估干眼炎症程度提供依据。

资料与方法

1 一般资料 收集我院门诊2012～2014年诊断为干眼患者60例，其中男性33例，女性27例，年龄25～58岁，平均年龄41.5岁。根据2013年干眼临床诊疗专家共识，将其随机分为轻度、中度和重度干眼患者(干眼严重程度诊断标准①轻度：轻度主观症状，无角结膜荧光素染色；②中度：中重度主观症状，有角结膜荧光素染色，但经过治疗后体征可消失；③重度：中重度主观症状，角结膜荧光素染色明显，治疗后体征不能完全消失)，所有患者均为双眼发病。所有患者排除病毒性角膜炎、Steven-Johnson综合征、眼表烧伤等病史及之前的长期眼部应用激素、环孢素、他克莫司、抗生素等眼部用药病史。

2 研究方法 共焦显微镜检查，重点记录角膜上皮下树突状细胞密度，即计数每幅共焦显微镜图像中树突状细胞数量，每例患者共计数三幅图像中树突细胞数量，取其平均值，每幅图像相当于角膜的实际面积为0.16mm2(即400μm×400μm)，再计算单位面积(1 mm2) 内的树突状细胞数量即为树突状细胞密度(个/mm2)。同时记录不同程度干眼患者共焦镜下活化细胞(具有明显分支结构的细胞)的比例。

3 共焦显微镜检查 对所有观察对象用药前及用药后1个月进行双眼的激光共焦显微镜检查并记录角膜上皮下树突状细胞密度。我们使用海德堡 Retina Tomograph III Rostock Cornea Module( HRT Ⅲ RCM) 激光共焦显微镜，HRT Ⅲ RCM 纵向分辨率约1 μm，可以实现活体角膜各层的图像。HRT Ⅲ RCM 的激光光源使用波长670 nm 的二极管激光。检查前，于结膜囊下穹隆部滴1 滴10g/L的盐酸奥布卡因和1 滴凝胶型人工泪液—2 g/L卡波姆( Bausch &Lomb，美国) 。检查在矢状轴进行，因此检查时能够精确显示角膜各层结构。对全部研究对象进行角膜中央区图像采集，每个患者在同一检查层面至少采集3张共焦显微镜图片。所有患者及正常对照组的检查均有一人完成。全部患者无检查引起的并发症发生。

4 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件对轻度、中度、重度干眼患者的角膜上皮下树突状细胞密度及活化细胞比例的分析应用方差分析，P<0.05认为具有统计学差异。

结 果

共焦显微镜下可见，轻度干眼、中度干眼、重度干眼患者角膜上皮下均可见树突状细胞浸润(图1～3)，轻度与中度、中度与重度、轻度与重度干眼患者之间比较树突状细胞密度均具有显著统计学差异(P<0.05)。随着干眼程度的加重，其上皮下树突状细胞密度呈增加趋势，见表1。

表1 轻度、中度、重度干眼患者树突细胞密度值

注：各组之间比较，P<0.05

伴随干眼发生，角膜上皮下树突状细胞由静止状态(共焦镜下表现为短棒状或椭圆形，如图1-3中黄色箭头所示)转变成活化状态(具有明显树突或伪足的细胞，如图1-3中红色箭头所示)，其活化细胞的比例亦随干眼程度加重而升高，见表2。

表2 轻度、中度、重度干眼患者共焦显微镜下活化的树突状细胞的比例

注：随干眼程度加重，其活化细胞的比例随之增加；采用单因素方差分析，F值为1064.3；各组之间比较，P<0.05

图1 轻度干眼患者角膜上皮下树突细胞密度低，多数细胞处于静止状态

图2 中度干眼患者角膜上皮下树突细胞密度增加，部分细胞处于活化成熟状态

图3 重度干眼患者角膜上皮下树突细胞密集，几乎所有细胞处于活化成熟状态，可见树突状或具有伪足的树突细胞，胞体增大，反光增强

讨 论

树突状细胞是抗原提呈细胞中加工、处理抗原并将抗原信息提呈给T淋巴细胞最强的一种抗原提呈细胞。这些活化树突状细胞主要通过快速释放大量细胞因子参与免疫应答。树突状细胞将抗原复合物提呈给相应的CD8+和CD4+T细胞，直接激活T细胞免疫应答，T细胞产生IL-2、6等细胞因子，活化巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞参与吞噬和免疫反应，同时分泌IL-17等刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞分泌多种细胞因子包括FGF、TNF、VEGF等。多种炎症因子的分泌组成网络，作用于自身的角膜、结膜、泪腺等眼表功能单位，进一步加重局部的炎症反应，形成恶性循环，从而导致干眼的发生发展。

目前，受临床观察手段限制，很难在活体上观察到角膜内树突状细胞。激光共聚焦显微镜应用于眼科临床，为我们提供了一种崭新的检查手段。使活体观察干眼等眼表疾病角膜变化成为可能，并应用其细胞计数软件对树突状细胞进行定量分析。在无创条件下，多次、反复提供角膜及眼表各层组织细胞图像，为确定疾病性质、发病机制和治疗疗效评估提供有力依据。

随着人们对树突状细胞的研究发现，除了角膜内皮层外，角膜上皮层、浅基质层内均可见树突状细胞，上皮层内中央及周边区均存在树突细胞[3]。正常人角膜上皮内树突状细胞的密度从角膜周边到中央部逐渐降低[4]，不仅密度降低，而且角膜缘和角膜周边部的树突状细胞处于成熟状态，中央及旁中央区域的树突细胞则处于未成熟状态，亦不表现激活标志。在我们的研究中，重点观察干眼患者的角膜中央区上皮下树突状细胞的密度变化和活化成熟状态。观察发现，干眼患者角膜中央区树突状细胞密度增加，并且随着干眼程度的加重，细胞密度呈现上升趋势，不仅数量增加，细胞活化成熟，由原来相对静止的短棒状、椭圆形细胞变成树突状或伪足样突起的粗大细胞，反光增强[5]，提示炎症反应加重。

此次研究结果进一步支持2013年我国关于干眼诊疗中抗炎治疗的规范，即对于中重度干眼患者除人工泪液外须给予糖皮质激素滴眼液、环孢素滴眼液或他克莫司滴眼液的局部使用，加强抗炎治疗。我们在临床中也观察到干眼患者经过以上抗炎治疗后角膜中央区上皮下树突状细胞数量减少，细胞趋于静止状态，患者症状及体征均减轻。因此，共焦显微镜下角膜中央上皮下的树突状细胞的密度和形态功能有助于我们观察干眼患者的炎症程度，对抗炎治疗后的疗效亦能进行有效评估，为治疗中应用糖皮质激素和免疫抑制剂提供了客观依据[6-7]。

[1] Lemp M，Baudouin C，Baum J，etal. The definition and classification of the dry eye disease :Report of the definition and classification subcommittee of the international dry eye workshop[J].The Ocular Surface，2007，5(2):75-92.

[2] Stern ME，Schauburg CS，Siemasko KF，etal. Autoantibodies contribute to immunopathogenesis of experimental dry eye disease [M] . Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(4):2062-75.

[3] Hattori T，Chauhan SK，Lee H ，etal.Characterization of Langerin-expressing dendritic cell subsets in the normal cornea[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(7):4598-4604.

[4] Zhivov A，Stave J，Vollmar B，etal.In vivo confocal microscopic evaluation of Langerhans cell density and distribution in the normal human corneal epithelium[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol ，2005，243(10)：1056-1061.

[5] Mayer WJ，Mackert MJ，Kranebitter N，etal.Distribution of antigen presenting cells in the human cornea: correlation of in vivo confocal microscopy and immunohistochemistry in differentipathologic entities[J].Curr Eye Res，2012，37:1012-1028.

[6] Wang Y，Zhao F，Zhu W，etal．In vivo confocal microscopicevaluation of morphologic changes and dendritic cell distribution in pterygium[J]．Am J Ophthalmol，2010，150：650-655．

[7] Mayer WJ，Mackert MJ，Kranebitter N. Distribution of antigenpresenting cells in the human cornea：Correlation of in vivo confocal microscopy and immunohistochemistry in different pathologic entities[J]．Curt Eye Res，2012，37(11)：1012-1018．

(收稿：2015-06-18)

Studies on the dendritic cells in the cornealepithelium of dry eye in vivo confocal microscopy Department of Ophthalmol First Hospital of Xi'an

(Xi'an 710002)

Zhu Haifeng Cheng Yan Wu Jie et al

Objective: To objective the density of dendritic cellsand the proportion of activated cells of different degree of dry eye patients in vivo confocal microscopy，so as to investigate the mechanism of dry eye ，to provide the basis for clinical diagnosis and treatment of dry eye.Methods: A case series with 60 consecutive cases of different degrees dry eye patients was investigated，examined with confocal microscopy in vivo，and at the same time the density of dendritic cells and the proportion of activated cells was recorded and analyzed with SPSS17.0 .Results:In mild dry eye，dendritic cell density was 26.7± 8.8/ mm2，with activated cell 29.0±3.7%; In moderate dry eye dendritic cell density was 69.6 ± 11.1 / mm2，with activate cell 83.5±7.6%; In severe dry eye dendritic cell density was 212.2 ± 31.0 / mm2，with activate cell 97.8±1.9%.The data showed that the corneal dendritic cell densityand the proportion of activated cells were found increased in more severe dry eye，with statistically significant difference .Conclusion:In vivo confocal microscope，dendritic cells is an important sign of dry eye inflammation.The proportion of activated cells and its density can be used as effective indicators to assess the degree of dry eye.

Microscopy，confocal Xerophthalmia/diagnosis Dendritic cells Cornea

*陕西省社会发展科技攻关项目(2015SF206)

显微镜检查，共焦 干眼病/诊断 树突细胞 角膜

R365

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.007