酶联免疫斑点试验对肺外结核病的辅助诊断价值*

西安市中心医院感染科(西安710003)

杜方雄 何 敏▲ 廉国利▲△

酶联免疫斑点试验对肺外结核病的辅助诊断价值*

西安市中心医院感染科(西安710003)

杜方雄 何 敏▲廉国利▲△

目的：评价酶联免疫斑点试验(ELISPOT)在肺外结核病诊断中的敏感性。方法：对87例初治的肺外结核病患者进行了酶联免疫斑点技术、病理检测、痰涂片找结核杆菌、结核PCR检测及结核IgG的检测，比较了不同方法的敏感性，并观察了酶联免疫斑点试验在不同部位肺外结核病中的敏感度。结果： ELISPOT对肺外结核感染的敏感度为73.6%，明显高于病理检测(37.3%)、痰涂片(6.5%)、结核抗体检测(14.6%)及结核PCR的检测(3.8%)。不同肺外结核感染酶联免疫斑点试验的敏感度不同。结论：酶联免疫斑点试验可作为肺外结核病诊断的重要检测方法，其在不同部位结核感染中的诊断价值不同。

有研究显示肺外结核病约占结核病的15%～25%[1]，在我国约9.7%～11.8%。由于其感染部位多样，临床表现复杂，易误诊及漏诊，诊断非常困难，急需新的高敏感的方法辅助诊断。酶联免疫斑点试验(ELISPOT)在肺外结核中的应用较少。我们用ELISPOT试验检测了87例肺外结核病患者，并与常用的其它诊断方法进行了比较，现报道如下。

对象和方法

1 研究对象 选取西安交通大学第一附属医院2013年1月至2014年12月收治的肺外结核病住院患者87例。所有患者经病原学、组织病理学、结核抗体、TB-PCR及影像学等检查结合临床病史或诊断性治疗确诊。其中男49例，女38例。

2 试验方法 患者入院后行病理检测、结核聚合酶链反应(PCR)、痰涂片抗酸染色、结核抗体检查及ELISPOT检测。ELISPOT检测使用T SPOT-TB(英国Oxford Immunotec Let)试剂盒。

ELISPOT操作方法：①采集患者外周静脉血3～4ml，肝素抗凝，于6h内进行试验 ②Ficoll液分离外周血单个核细胞，用培养液将细胞浓度调整为2.5×105个/ml，加入预包被INF-γ抗体的96孔微孔板里，每份4个孔，分别作为阳性对照阴性、两种实验抗原及阴性对照;③加入抗原:按照分组相应加入植物血凝素PHA、抗原A(ESAT-6)、抗原B(CFP-10)、细胞培养液。 ④温箱培养 24 h; PBS洗板4次，加入生物素标记的二抗;加入亲合素标记的酶结合物,使底物显色;⑤结果判断:用计算机辅助成像分析系统进行斑点阅读与统计。阳性对照孔如出现斑点，说明试验成功。当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果：①如果阴性对照孔斑点数为0～5个，测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6。②如果阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔斑点数必须≥2倍的阴性对照孔斑点数。

3 统计学方法 运用SPSS17．0统计学软件，组间率的比较采用卡方检验，配对资料进行配对卡方检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 肺外结核病患者基本情况和结核病累及部位 结核病患者的平均年龄为44.58岁(0.75～87岁)。其中受累最多的部位是骨/关节结核(n=22)，其次为胸膜和腹膜(分别为n=19)。在这些肺外结核患者中T-SPOT阳性率为73.6%，其中T-SPOT阳性率最高的是多发部位结核患者(100%)，其次为结核性腹膜炎(84.2%)及淋巴结核(83.3%)，骨/关节结核阳性率最低(54.5%)，多部位结核感染中有结核性心包炎合并胸膜炎2例，结核性胸膜炎合并腹膜炎2例，睾丸结核合并淋巴结核、肺结核1例，淋巴结核合并肾结核1例，结核性胸膜炎合并腹膜炎、心包炎1例。其它结核感染中包括有，皮肤结核1例，肠结核1例，结核性心包炎2例。具体见表1。

表1 87例肺外结核病患者的临床特点及T-SPOT检测结果

2 ELISPOT试验在肺外结核病诊断中的敏感性 评价肺外结核病患者中，ELISPOT方法检测的阳性率为73.6%，而病理诊断、PCR、痰涂片、结核抗体检查的阳性率分别为37.3%、3.8%、6.5%、14.6%，ELISPOT阳性率显著高于其它辅助检查，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。为了提高PCR的阳性率，部分结核性胸膜炎及结核性腹膜炎的患者同时采用了胸水及外周血检测PCR。

表2 ELISPOT与其它各种方法检查阳性率的比较

3 ELISPOT与结核PCR试验的比较 51例肺外结核患者同时做了ELISPOT和病理检测，将这两种方法进行了比较，ELISPOT方法阳性率82.4%明显高于病理方法阳性率37.3%，差异有统计学差异(P<0.05)。

4 ELISPOT与结核抗体IgG的比较 41例肺外结核患者同时做了ELISPOT和结核抗体IgG，这两种方法进行了比较，ELISPOT方法阳性率90.2%明显高于结核抗体IgG的阳性率性14.6%，差异有统计学差异(P<0.05)。

讨 论

目前，肺外结核病的实验室诊断方法主要有细菌学检查、结核抗体和抗原检测、分子生物学诊断，其中细菌学检查是诊断的金标准，常用的方法有涂片镜检和分枝杆菌培养，由于分枝杆菌培养耗时长，阳性率低，因此临床开展率低于涂片镜检。涂片镜检方法简单，但因肺外结核病合并肺结核的发病率不高，因此痰中找到结核杆菌的几率低，而且痰菌检测的检出率本身不高，敏感性低，在本研究中痰涂片阳性率仅6.5%。故该方法远不能满足诊断需求。外科方法取组织病理检测是确诊肺外结核的另一种重要方法，本研究中用病理方法检测阳性率达37.3%，相对于痰涂片、结核抗体检测及结核PCR检测，敏感性较高，但因活检为有创检查，操作上要求高，不能广泛应用。

ELISPOT原理为将结核杆菌所特有，而卡介苗和其它分枝杆菌没有的两种抗原ESAT26和CFP10作为抗原刺激感染了结核分枝杆菌患者的记忆性T细胞增殖分化，释放IFN-γ，通过检测这些细胞来判别机体是否感染结核。该方法在活动性结核感染和隐性结核感染中的敏感度和特异度很高，其应用价值得到了广泛认可，但其在肺外结核中的应用报道却不多。本研究中收集了87例肺外结核病例，ELISPOT对肺外结核感染的敏感度为73.6%，与有关报道[2]中的敏感性79.8%相似，但低于Fan等[3]做的荟萃分析显示的敏感度(90%)。我们将ELISPOT方法与其它常见的诊断方法进行了比较，明显高于病理检测(37.3%)、痰涂片(6.5%)、抗体IgG检测(14.6%)及PCR的检测(3.8%)，说明它是一种非常有效的诊断肺外结核病的有用的方法。

因肺外结核感染部位不同，临床表现各不相同。本研究中骨/关节结核是肺外结核感染中所占比例最高，其次为结核性腹膜炎和结核性胸膜炎。与其它两项研究一致的是不同肺外结核感染ELISPOT的敏感度是不同的[4，5]，但与他们研究不同的是各种肺外结核的敏感度不同。本研究中ELISPOT在结核性脑膜炎敏感度较低，为71.4%，而多部位结核感染者的敏感度最高，达100%，其次为结核性腹膜炎(84.2%)和淋巴结核(83.3%)，而发病最高的骨/关节部位结核感染者阳性率最低，为54.5%。结核性胸膜炎的敏感度与Liao等的研究相同，均为73.7%。本研究中因本研究中无结核性心包炎及肠结核病例，故未能进行比较。两组研究中的敏感度不同可能与各种肺外结核病病例数量少，偏差相关，需扩大样本量来明确。

总之，肺外结核病中ELISPOT方法敏感度高，可作为肺外结核病诊断的重要检测方法。不同部位结核感染中的敏感度不同，该方法在不同肺外结核感染中应用价值仍需更大样本的资料来确定。

参考资料

[1] Mehta PK, Raj A, Singh N，etal. Diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by PCR [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2012, 66 (1):20-36.

[2] Kim SH, Choi SJ, Kim HB,etal. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis [J]. Arch Intern Med, 2007, 167：2255-2259.

[3] Fan L,Chen Z,Hao XH,etal.Interferon-gamma release assays for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis:a systematic review and meta-analysis[J]. FEMS Immunol Med Micmbiol, 2012, 65 (3):456-466.

[4] Feng Y, Diao N, Shao L,etal. Interferon-gamma release assay performance in pulmonary and extrapulmonary tuberculosis [J]. PloS One, 2012, 7(3): e32652.

[5] Liao CH, Chou CH, Lai CC,etal. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-γ in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease [J]. J Infect, 2009,59: 402-404.

(收稿：2015-03-10)

*陕西省自然科学基金(2012JM4049)

结核/诊断 @ELISPOT

R52

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.035

▲西安交通大学医学院第一附属医院

△通讯作者