循环MPs对pH大鼠肺动脉舒张功能的影响*

西安交通大学医学院第一附属医院心内科 (西安 710061)

韩稳琦 陈春燕 韩新源△ 潘军强△ 程 功△ 孙超峰#

循环MPs对pH大鼠肺动脉舒张功能的影响*

西安交通大学医学院第一附属医院心内科 (西安 710061)

韩稳琦 陈春燕 韩新源△潘军强△程 功△孙超峰#

目的： 探讨肺动脉高压大鼠体内循环微颗粒(MPs)对肺动脉血管舒张功能的影响，以进一步阐述肺动脉高压的发病机制。方法：雄性SD大鼠12只随机分为两组，正常对照组(C组，n=6)、MCT模型组(M组，n=6)，M组大鼠按照50mg/kg剂量一次性腹腔注射野百合碱诱导肺动脉高压模型，C组大鼠一次性腹腔注射与M组等量乙醇生理盐水混合液；常规喂养20d后行右室插管测定大鼠右室收缩压(RVSP)，而后采用腹主动脉采血法取血并提取MPs，将提取的MPs刺激大鼠肺动脉，观察MPs对大鼠肺动脉血管舒张功能的影响。结果：C组来源的MPs对肺动脉血管舒张功能无影响，M组来源的MPs部分抑制肺动脉的舒张功能。结论： 肺动脉高压大鼠体内的循环MPs通过抑制肺动脉舒张进而加重肺动脉高压的病情进展。

肺动脉高压(Pulmonary hypertension, pH)为一类极度严重的疾病，严重危害患者身心健康。以往研究报道肺动脉高压大鼠肺动脉血管舒张功能显著受损[1]。循环微颗粒(Circulating microparticles，MPs)是内皮细胞、白细胞、血小板发生凋亡或受到病理刺激时分泌的微粒，参与炎症反应、激活凝血系统及侵蚀内皮细胞[2,3]。近期研究还发现MPs通过影响内皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric oxide synthase, eNOS)和弹性蛋白(Elastin)参与肺动脉高压的发生和发展。我们将通过研究MPs与肺动脉血管舒张功能的关系来进一步探讨肺动脉高压的发病机制。

材料与方法

1 实验动物 雄性SD大鼠12只，体重200±10g，购自西安交通大学医学院动物中心。

2 试剂和药品 野百合碱(Monocrotaline, MCT)、氯化乙酰胆碱(Ach)、重酒石酸去甲肾上腺素(Noradrenaline Bitartrate, NA)、戊巴比妥钠、L-硝基精氨酸(L-NAME)均购自Sigma公司。K-H液配置：NaCl 118.0 mmol/L、CaCl22.5 m mol/L、KH2PO41.2 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325.0 mmol/L、glucose 11.0 mmol/L，均为普通国产分析纯。

3 仪 器 MD 2000生物信号采集系统购于南京医科大学，BL-420E生物机能试验系统购于成都泰盟科技有限公司。

4 pH模型制备及分组 按文献报道方法制备pH模型[3]：生理盐水和乙醇(8∶2)混合液将MCT配制成浓度20 g/L的溶液。将12只雄性SD大鼠随机分为：对照组(C组，n=6)和MCT组(M组，n=6)。M组大鼠以50 mg/kg比例一次性腹腔注射MCT溶液以诱导pH，C组大鼠一次性腹腔注射与M组等量生理盐水和乙醇(8∶2)混合液，随后两组大鼠继续常规饲养20d。

5 检 测

5.1 肺动脉压力的检测： 饲养20d时，戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，用充满6250U/L肝素盐水的硅胶管(外径0.9mm，内径0.6mm) 经颈外静脉置管，一端插入右心室，另一端接压力换能器并连入BL-420E 生物机能试验系统记录右心室收缩压(Right ventricular systolic pressure，RVSP)[4]以间接反应肺动脉压力。

5.2 MPs提取及测定 : 按文献报道用两步法提取MPs：血液先离心(4℃ 11000g 2min)获得乏血小板血浆，然后取2ml乏血小板血浆移入1.5ml EP管后再第二次离心(4℃ 13000g 45min)后尽量吸去上清，MPs沉淀于EP管管底，向EP管内加100μl RPMI 1640培养基并吹悬MPs。MPs的蛋白浓度用BCA试剂盒测定后进行下一步实验(或放-80℃冰箱保存)。

5.3 肺动脉舒张功能检测：其余6只大鼠，行开胸取肺动脉，立即置于预冷并灌注混合气(95% CO2混合气体)的K-H液中，小心剥离动脉周围结缔组织，后将肺动脉横切为3～4 mm宽的血管环，然后将血管环移入盛有预先通气、37±0.5℃的K-H液的浴皿中，小心将血管环套在浸泡在浴皿中的张力传感装置上，连接MD 2000生物信号采集系统。浴皿中持续通气，保持恒温，然后给予2g前负荷并让血管环平衡60min，期间每间隔15min换1次K-H液。平衡结束后，加入KCl(浴皿浓度10-6mol/L)反复收缩3次，以检测血管环的稳定性。用K-H液洗脱KCl至基线后进行下列实验：分别用等量的C组和M组的MPs(1mg/ml)孵育血管环30min后用NA(浴皿浓度10-6mol/L)收缩血管环至最大张力值(Vmax)，然后加入Ach(浴皿浓度10-7～10-4mol/L)并记录不同Ach浓度的张力值(Vach)，测定舒张百分比：(Vmax-Vach)/Vmax。洗脱各种药物后用L-NAME (100umol/L)孵育血管环30 min，再次用NA和ACh处理血管环以了解eNOS依赖的血管舒张功能。

结 果

1 RVSP测定 各组大鼠RVSP测量结果，见表1。

表1 各组RVSP (±s)

注：与C组比较，*P<0.05

2 MPs测定 各组大鼠MPs的测量结果，见表2。

表2 各组MPs(±s)

注：与C组比较，*P<0.05

3 血管舒张功能的测定 与C组比较(88.71±1.36)，M组(40.57±3.64)MPs损害了肺动脉血管的舒张功能。L-NAME(eNOS的特异性抑制剂)同样抑制了Ach舒张血管的功能，提示MPs损害肺动脉血管内皮依赖的舒张功能。pH时，肺血管舒张功能受损可能是通过MPs实现的。

讨 论

我国是烟草消费大国，因此慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等慢性肺部疾病发病率明显高于其他国家；支气管扩张、肺结核等长期病理刺激最后也会导致pH，并可引起右心衰竭。我们的实验结果显示：pH时大鼠体内MPs含量升高，这些升高的MPs损害了内皮依赖的舒张功能，进而继续加重pH从而形成一个恶性循环的病理生理过程。

MPs是机体在受到高切应力、C 反应蛋白、肿瘤坏死因子等刺激时由血小板、内皮细胞等以出芽方式分泌的亚微米级颗粒，越来越多的研究发现MPs可以反映内皮损伤和内皮功能障碍[5]。Ci等[6]研究还发现MPs可减少内皮细胞eNOS的表达和一氧化氮(NO)的产生。我们最近的研究也发现pH大鼠体内增高的MPs可以减少离体肺血管中eNOS的蛋白表达，增加elastin的表达。本研究显示： pH大鼠MPs含量升高，而升高的MPs进而损害内皮依赖的离体大鼠肺动脉血管的舒张功能。

肺血管的压力由肺血管的收缩力和舒张力决定，而血管的收缩和舒张是由内皮分泌的收缩因子和舒张因子之间的相互作用调控的，正常时二者处于稳态。已有研究报道：肺血管的舒张因子主要是由eNOS产生的NO介导的。NO主要通过以下作用影响肺动脉压力：调节血管紧张度、抑制平滑肌细胞增殖和抑制血小板聚集。此研究发现来源于M组的MPs抑制了肺血管内皮依赖的(由eNOS的特异性抑制剂L-NAME体现)血管舒张功能，肺血管舒张功能的受损必将使肺血管压力升高而加重pH病情。

综上所述：pH时大鼠体内的MPs含量升高，这些MPs可以损害肺血管内皮依赖的舒张功能，进而形成了：pH→ MPs →舒张功能受损→ pH加重的恶性循环。进一步阐述了pH的发病机理，为将来寻找pH的防治策略提供了一定的理论基础。

[1] 王群让，王旭兰，代晓霞. 精氨酸防治肺动脉高压的研究[J]. 陕西医学杂志，2014，43(9):1115-1117.

[2] Wang JM, Huang Y J, Wang Y,etal. Increased circulating CD31+ / CD42 - microparticles are associated with im paired systemic artery elasticity in healthy subjects[J]. Am J Hypertens, 2007,20(9):957-964.

[3] Hugel B, Carmen M, Martinez MC,etal. Membrane microparticles: two sides of the coin[J]. Physiology，2005，20(1): 22-27.

[4] 常凤军，魏 伟，欧志君，等. 左旋精氨酸恢复eNOS和iNOS平衡并抑制肺动脉高压的研究[J].中华胸心血管外科杂志，2012，28(4):237-240.

[5] 王 妍,陶 军,杨 震,等. 肿瘤坏死因子促进内皮微颗粒释放的实验研究[J]. 中华心血管病杂志, 2005, 33(12): 1137- 1140.

[6] Ci HB, Ou ZJ, Chang FJ ,etal. Endothelial microparticles increase in mitral valve disease and impair mitral valve endothelial function[J]. American Journal of Physiology- Endocrinology and Metabolism. 2013，304(7):E695-702.

(收稿：2015-03-17)

*陕西省自然科学基金资助(2013JC-16)

肺动脉 血管舒张 @循环微颗粒

R544

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.004

△陕西省人民医院心血管内二科

#通讯作者