独角莲多糖的提取及体外抗肿瘤活性研究

杜新春， 宋艳玲， 庞 颖， 殷连保， 张 毅， 戴宏斌

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

独角莲多糖的提取及体外抗肿瘤活性研究

杜新春， 宋艳玲， 庞 颖， 殷连保， 张 毅， 戴宏斌

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

利用水提醇沉法从独角莲中提取多糖，Sevag 法除蛋白纯化多糖，苯酚-硫酸分光光度法测定多糖的含量.采用噻唑蓝(MTT)法检测独角莲多糖对人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株Bel-7402抑制生长作用.结果表明:独角莲多糖具有一定的体外抗肿瘤活性，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制活性明显加强.

独角莲； 多糖； 抗肿瘤活性

多糖是一种广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是一种重要的生物体能量资源和构成材料，同时还参与细胞的多种活动.研究表明:许多植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗辐射和延缓衰老等生物活性[1-2].独角莲(TyphoniumgiganteumEngl.) 为天南星科(Araceae) 犁头尖属(Typhonium Schott) 植物，是中国特有的一种植物，现全国各地亦多栽培.独角莲中含有多种化学成分，例如甾类、脂肪酸、挥发油及多糖类化合物[3].现代医学研究表明:独角莲水提物及醇提物具有抗肿瘤、抗氧化等多种活性作用[4-7].本文利用水提醇沉法从独角莲中提取多糖成分，以苯酚-硫酸分光光度法测定多糖含量，通过对人肺癌A549肿瘤细胞、人肝癌Bel-7402肿瘤细胞体外抑制生长活性测试，初步研究独角莲多糖的体外抗肿瘤活性.

1 实验材料与方法

1.1 仪器及试剂

721型分光光度计：上海光学仪器厂；DF1015-集热式磁力加热搅拌器、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵：巩义市予华仪器厂；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：上海齐新科学仪器有限公司；CO2培养箱：日本，三洋；离心机：上海知信实验仪器技术有限公司；酶联免疫检测仪：深圳雷杜电子公司.

独角莲鲜球根茎：市售，产地吉林；葡萄糖：中国药品生物制品检定所；RPMI-1640：美国Gibco公司；链霉素、青霉素：美国HyClone公司；MTT：美国Sigma公司；10 %灭活的胎牛血清：天津灏洋生物制品科技有限责任公司；人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株Bel-7402：中国科学院上海生命科学研究院；其他溶剂均为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 独角莲多糖的提取和含量测定

独角莲鲜球根茎洗净，切成约5 mm的厚片，经50 ℃烘干，粉碎，过60目筛，备用；称取干燥的独角莲根茎粗粉100 g，加入体积分数为80 %的乙醇1 000 mL，浸泡8 h，加热回流提取2 h，过滤，药渣干燥后，加入1 000 mL水回流提取2 h，重复3次，合并提取液.将合并的提取液浓缩至100 mL，加入400 mL乙醇，置于4 ℃冰箱中醇沉过夜.抽滤，滤饼依次用乙醇和丙酮洗涤，得到粗品多糖.将10 g粗品多糖溶于100 mL水中，加入V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1的混合溶液400 mL，混合物剧烈振摇30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质，重复进行3次.合并溶液，浓缩至100 mL，加400 mL乙醇，置于4 ℃冰箱中醇沉过夜.抽滤，滤饼依次用乙醇和丙酮洗涤，干燥，得到独角莲多糖.

称取葡萄糖标准品100 mg，溶于蒸馏水并定容至100 mL.精确移取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，配成6个浓度梯度的葡萄糖标准溶液.分别移取6个不同浓度的标准溶液1.0 mL于具塞试管中，每管加入1 mL体积分数为5 %的新制苯酚溶液，迅速加入浓 H2SO4后摇匀，静置 5 min，沸水加热30 min，用冰水冷却至室温，测定490 nm处各管中溶液的吸光度值.以葡萄糖标准溶液质量浓度(ρ，mg/L)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程.

称取独角莲多糖10 mg，用蒸馏水溶解，定容至50 mL.精密移取此溶液1.0 mL于具塞试管中，根据苯酚-硫酸分光光度法测定吸光度，由回归方程计算多糖样品溶液中葡萄糖的浓度.

1.2.2 独角莲多糖体外抗肿瘤活性研究

细胞接种于体积分数为10 %的灭活的胎牛血清RPMI-1640培养液中，加入100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素，在37 ℃恒温、体积分数为5 %的CO2及饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行试验，将细胞以5×103个细胞/孔接种于96孔培养板中，培养过夜.多糖给药组质量浓度分别为1.0、10.0、100.0 g/L，每组均设 3个平行孔，分别培养24、48、72 h.以MTT法测定波长490 nm处各孔的吸光度值(OD值)[8].肿瘤细胞存活率(SR)、肿瘤细胞抑制率(IR)根据以下公式计算：

SR=(OD给药组/OD对照组)×100 %

IR=(1-SR)×100 %

2 结果与讨论

2.1 独角莲多糖的含量测定结果

利用苯酚-硫酸分光光度法，对6个不同浓度的标准葡萄糖溶液在 490 nm的波长处测定吸光度，结果见表1.

表1 6个不同质量浓度标准葡萄糖溶液吸光度测试结果

以葡萄糖标准溶液质量浓度(ρ，mg/L)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程.A=0.006 82ρ+0.003 4，r=0.998，葡萄糖在10～60 mg/L的浓度时与吸光度呈现出良好的线形关系.通过测定，独角莲多糖样品溶液的吸光度A=0.114 2，利用回归方程计算样品中葡萄糖质量浓度为16.25 mg/L，以独角莲多糖中葡萄糖含量为标准，计算多糖的质量分数=16.25/200×100 %=8.12 %.

2.2 独角莲多糖对人肺癌细胞株A549细胞、人肝癌细胞株Bel-7402细胞的体外抑制活性

MTT检测结果表明：独角莲多糖具有一定的抑制人肺癌细胞株A549细胞增殖的作用，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制活性明显加强，见表2.

MTT检测结果表明：独角莲多糖具有一定的抑制人肝癌细胞株Bel-7402细胞增殖的作用，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制活性明显加强，见表3.

表2 独角莲多糖对人肺癌细胞株A549的生长抑制作用

注：a.对照组是生理盐水；b.吸光度值在490 nm处测定.

表3 独角莲多糖对人肝癌细胞株

注：a.对照组是生理盐水；b.吸光度值在490 nm处测定.

3 结 论

植物多糖类化合物具有抑制肿瘤生长、激活免疫细胞、改善机体免疫功能等作用，已成为当今新药的发展方向之一.从中药植物独角莲中提取出多糖，用苯酚-硫酸分光光度法测定其多糖含量，此法简便易行，便于实际应用.实验表明：独角莲多糖对人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株Bel-7402具有一定抑制生长作用，因此，独角莲多糖具有较大的潜在应用价值，值得进一步深入研究.

[1] 董群，方积年.多糖在医药领域中的应用[J].中国药学杂志，2001，36(10):649-651.

[2] 黄瑞松.中草药多糖含量测定方法概述[J].中国药师，2005，8(1):6870-6875.

[3] 胡长效，朱静，孙晓静.独角莲的化学成分及药理作用研究进展[J].农业与技术，2007，27(2):50-54.

[4] 王顺启，倪虹，王娟，等.独角莲对肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖抑制作用机理的研究[J].细胞生物学杂志，2003，25(3):185-187.

[5] 王顺启，倪虹，王问顺，等.独角莲水提取物对肝癌细胞SMMC-7721基因表达的影响[J].中草药，2006，37(9):1384-1387.

[6] 王林美，叶博，赵振军，等.独角莲抑制乳腺癌 MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用研究[J].沈阳农业大学学报，2009，40(2):174-177.

[7] 尹建元，朴春姬，杨建增，等.禹白附抗肿瘤活性研究(I)[J].长春中医学院学报，2000，16(2):52-53.

[8] 李荣辉，王玉，郑丽红，等.树舌多糖抑制胃癌MGC-803细胞增殖及对EGFR表达的影响[J].时珍国医国药，2010，21(3):582-587.

Extraction of Polysaccharide fromTyphoniumGiganteum
Engl.and Its Anticancer Activities in Vitro

DU Xin-chun， SONG Yan-ling， PANG Ying， YIN Lian-bao， ZHANG Yi， DAI Hong-bin

(Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110042， China)

Polysaccharide was extracted fromTyphoniumgiganteumEngl.by water-extraction-alcohol-precipitation method，the deproteinization was performed by Sevag method，and the content of polysaccharide was deter mined by phenol sulfonic acid spectrophotometry.The antitumor activities ofTyphoniumgiganteumEngl.tuber polysacchayide in human Liver Cancer Bel-7402 and Lung Cancer A549 Cell Lines were measured by MTT method in vitro.The result suggestedTyphoniumgiganteumEngl.tuber polysacchayide could decrease the proliferation rate of Bel-7402 and A549 cells and cellular proliferation were inhibited with the increase of concentration and time.

TyphoniumgiganteumEngl.； polysacchayide； anticancer activity

2013-08-26

国家级“大学生创新创业训练计划”项目(201210149004)；辽宁省教育厅项目(L2012146)

杜新春(1992-)，女，辽宁普兰店人，本科生在读，主要从事天然产物生物活性研究.

宋艳玲(1977-)，女，吉林通化人，副教授，博士，主要从事天然产物生物活性研究.

2095-2198(2015)01-0007-03

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.01.002

R978.1

A