椎间盘髓核细胞表型的研究进展

蔡峰，吴小涛，王锋

(东南大学医学院附属中大医院 脊柱外科，江苏 南京 210009)

·综 述·

椎间盘髓核细胞表型的研究进展

蔡峰，吴小涛，王锋

(东南大学医学院附属中大医院 脊柱外科，江苏 南京 210009)

髓核细胞特异性表型是识别髓核细胞和研究其生物学行为的基础，同时也是基因干预、细胞移植等生物学修复椎间盘退变的前提。髓核细胞兼有软骨细胞和脊索细胞的表型特点，而特定基因的转录和表达调控又广泛受到椎间盘局部微环境以及椎间盘退行性变的影响。部分髓核细胞亚群还具有祖细胞的生物学特性并表达特定的表型。对髓核细胞表型的研究有助于推动椎间盘退变生物学治疗的进展。

椎间盘退变；髓核细胞表型；软骨细胞；脊索细胞；髓核祖细胞；文献综述

椎间盘退行性变是一个多因素参与的对椎间盘成分、结构、功能渐进性破坏的慢性过程。近年来，采用细胞移植、基因干预和细胞因子注射等生物学治疗手段来恢复髓核细胞的数量和功能是研究的热点[1-2]。但目前对髓核细胞表型的认识仍局限于其表达软骨表型：Ⅱ型胶原(COL2)和聚集蛋白聚糖(ACAN)。干细胞移植后是否能分化成为真正的髓核细胞，仍缺少鉴定的标准。因此，对髓核细胞表型特征的全面认识，有助于指导生物学治疗。作者就髓核细胞表型的研究进展作一综述。

1 髓核细胞表型

1.1 髓核细胞表达软骨表型

2002年Sive等首次在人椎间盘细胞中检测出软骨细胞表型COL2、ACAN和SOX9基因[3]。他还发现在正常髓核细胞中三者表达呈强阳性，而纤维环中略微表达或不表达;在退变椎间盘髓核细胞中依然能表达SOX9，但是COL2和ACAN表达明显降低，尤其是ACAN。尽管关节软骨细胞、纤维环细胞和髓核细胞中均表达COL1，且表达量在3种细胞中差异不明显，但是结合COL2和ACAN的表达，仍能将髓核细胞与其他椎间盘细胞相区别[4]。此外，Clouet等[4]还分别比较了兔关节软骨细胞、纤维环细胞和髓核细胞中COL2/COL1、COL2/ACAN的两个比值，发现在关节软骨和髓核细胞中，COL2/COL1值远远大于纤维环细胞(关节软骨细胞≈1 800，髓核细胞≈1 000，纤维环细胞≈1)，说明在关节软骨和髓核细胞中主要以COL2为主，而纤维环中则以COL1为主。在关节软骨细胞中COL2/ACAN值又远远大于髓核细胞(关节软骨细胞≈1 100，髓核细胞≈1)，提示高表达ACAN是髓核细胞的显著特征。

1.2 髓核细胞表达脊索细胞的表型

脊索细胞是胚胎发育过程中脊索的残留物，细胞体积较大(直径30～40 μm)，通常以团状出现，细胞内含有空泡，至少占细胞总体积的25%。在人类，脊索细胞随着年龄的增加而丢失，青春期以后就很难检测到，然而在鼠类、兔子等动物体内这些细胞却能长久保留。

有研究显示，尽管成人髓核中罕见具有空泡特征的脊索样髓核细胞存在，但却能检测到脊索细胞特征性表型分子表达，如：T基因，细胞角蛋白-8、-18、-19(CK-8、-18、-19)，半乳凝素-3(Gal-3)，配对盒基因1(PAX1)和叉头盒基因1(FOXF1)。T基因(又称Brachyury)编码的蛋白质是一个胚胎期的核转录因子，影响中胚层形成和分化所需基因的转录[5]。这个蛋白存在于脊索来源的细胞中，被认为是在胚胎期或脊索瘤中调节软骨形成，是脊索分化和生长过程所必需的[6]。

Minogue等[7]利用密度梯度离心法分离牛髓核细胞和脊索细胞，并用RT-PCR检测两种细胞中T基因的表达，发现T基因在脊索和髓核细胞中均表达，两者差异不超过10倍，同时在髓核细胞中的表达远远大于关节软骨(≈100倍)和AF(≈50倍)，并且其表达量不因髓核退变程度的增加而减少。

此外，髓核细胞还表达CK-8、-18、-19，Gal-3等脊索细胞表型，尽管与脊索细胞相比，其表达量在髓核细胞中略低，但差异不超过10倍[7-10]。然而，在髓核细胞CK-8、-18、-19的表达远远大于在纤维环(CK-8≈2 544倍，CK-18≈1 860倍，CK-19≈50倍)和关节软骨(CK-8≈7 600倍，CK-18≈15 990倍，CK-19≈36倍)[7]。这些基因在髓核、纤维环和关节软骨细胞间的差异表达使它们可能成为髓核细胞特征性的表型。T基因，CK-8、-18、-19以及Gal-3的高表达不仅可以将髓核细胞与纤维环细胞或软骨终板细胞相区别，而且在一定程度上提示髓核细胞来源于胚胎发育过程中脊索细胞在椎间盘内的残留[7]。

胚胎发育过程中椎间盘以及髓核组织的形成受到严格的信号调控。Choi等发现，表达shh基因的脊索细胞形成髓核组织，但对纤维环和终板的形成不是必须的[11]。在没有shh参与下，髓核细胞就不能表达其表型，而纤维环和终板软骨细胞则能表达，但有所减少[12]。研究发现， PAX1和FOXF1这两个基因的表达是由shh信号轴激活的[13]。PAX1参与胚胎期调节椎间盘生成，FOXF1与椎间盘细胞生长、增殖有关[14-15]。在人髓核细胞中，PAX1和FOXF1基因的表达量分别是软骨细胞的2 000倍和100倍。PAX1和 FOXF1在髓核细胞和软骨细胞中的表达差异进一步提示，髓核细胞起源于脊索细胞，并继承了脊索细胞的表型特征。

1.3 髓核细胞表达环境相关性基因

髓核细胞中表达一些与椎间盘缺血缺氧环境相关的基因，比如低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白-1(GULT-1)、血管内皮生长因子(VEGF-A)、碳酸酐酶-12(CA12)和血红蛋白β链(HBB)。HIF-1是低氧诱导结合蛋白，是一种碱基-螺旋-环袢-螺旋PAS异二聚蛋白质，有α、β两个亚基构成。富氧状态下HIF-1α很快被降解，而缺氧状态下HIF-1α稳定，并进入细胞核，与HIF-1β结合后激活下游基因的转录。Rajpurohit比较了髓核、纤维环和终板软骨中HIF-1的表达情况，发现在三者中均表达HIF-1β，但是只有在髓核细胞中表达HIF-1α[16]。GULT-1、VEGF-A和CA12受HIF-1α的调控，三者在髓核细胞中高表达，而在纤维环和软骨细胞中低表达或不表达，GULT-1能够提高髓核细胞摄取葡萄糖能力，用以糖酵解和合成糖蛋白，VEGF-A具有促血管生成和促有丝分裂的作用，CA12是髓核细胞表面分子，用以维持细胞内pH值[17-18]。

1.4 髓核细胞表面特征性的CD分子

研究发现，髓核细胞特征性地表达一些CD分子，高表达CD24、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，几乎不表达CD34、CD14、CD45和CD133(表1)，其中CD24被认为是髓核细胞特异性的标记[19]。Fujita等[20]发现，CD24在人髓核细胞的表达水平远远大于纤维环、软骨、骨、皮肤等9种组织，并且在突出髓核与正常髓核中表达无明显差异。另外，他们还发现在脊索细胞来源的脊索瘤组织中高表达CD24，而间叶组织来源的软骨瘤组织却不表达CD24。

1.5 髓核细胞鉴定时的阴性标记

Minogue等[9]运用基因芯片和RT-PCR技术筛选出4个在人关节软骨细胞中表达远远大于髓核细胞中表达的基因：生长分化因子10(GDF10)、骨唾液酸糖蛋白(IBSP)、细胞因子1(CYTL1)、纤蛋白1(FBLN1)。这些基因在关节软骨和髓核细胞中表达差异在100倍以上，因此，Minogue认为这些基因在髓核细胞中表达阴性而在关节软骨细胞表达阳性，是鉴定髓核细胞的阴性标记。

表1 CD分子在髓核细胞中表达情况

2 正常和退变髓核细胞中表型差异

退变髓核细胞通过调控某些基因的表达量，最终使细胞内分解代谢增加，合成代谢减少，细胞功能减退。其中表达上调的基因主要有骨母细胞特异性因子-2(periostin)、COL1、基质Gla蛋白(MGP)、FBLN1、基质金属蛋白酶-2和-9(MMP-2、-9)，下调的基因主要有COL2、ACAN、SOX9、突触小体相关蛋白(SNAP25)、神经-钙黏素CDH2和CK-8、-18、-19[21-22]。

Periostin是一种细胞外基质蛋白，具有细胞黏附功能，在组织生长和损伤修复过程中促进胶原产生和有效交联，但同时Periostin还与整联蛋白αvβ3结合，诱导下游基因磷酸化，最终导致成纤维细胞过度表达COL1，促使病变组织纤维化[21]。此外，Periostin与MMP-2前体结合，能促进其水解，形成有活性的MMP-2，两者在退变髓核细胞中表达量显著增加并且成正相关[21]。MGP是一种表达于骨和软骨中的维生素K依赖蛋白，在软骨内成骨、病理性钙化和骨折愈合过程中上调表达。随着髓核细胞的逐渐老化，MGP的表达增加，Lee等发现，在年轻人(<54岁)髓核细胞中用免疫组化法不能检测出MGP表达，而在退变的老年人髓核细胞中可以检测到MGP的表达[8，10]。FBLN1在正常髓核细胞和纤维环细胞中几乎不表达，但是在退变椎间盘细胞中表达明显增加。FBLN1能增强血小板反应蛋白-1 (ADAMTS-1)分解蛋白多糖的能力，减少细胞外基质中蛋白多糖的含量，加速椎间盘退变的发展[7]。

SOX9、COL2、ACAN 3个基因是经典的软骨细胞表型，在退变髓核细胞中，三者表达明显降低[3，21]。SOX9是软骨表型的主要调控基因，能有效促进ACAN的表达，在椎间盘退变中SOX9表达下降以及MMP表达升高，COL2和ACAN合成减少，分解增加。Minogue等首次发现在牛髓核细胞中表达SNAP25和CDH2，而在关节软骨中几乎不表达，并且随着椎间盘的退变，髓核细胞中SNAP25和CDH2的表达量逐渐降低[7]。SNAP25参与细胞膜融合和胞吐过程，CDH2在间充质性凝聚物和软骨形成过程中起重要作用，但是两者在髓核细胞中的作用还不明确。

3 髓核祖细胞表型

近年来，越来越多的研究认为在椎间盘中可能存在髓核祖细胞，这种细胞与软骨样髓核细胞不同，它具有增殖能力，表达增殖细胞核心抗原PCNA，并且具有多向分化潜能。髓核祖细胞表达胚胎干细胞或间充质干细胞特征性的表型，比如Oct3/4、Sox2、Nanog、CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)、Notch1和Jagged1。这些基因在细胞增殖和分化中起调控作用，使髓核祖细胞能够维持干细胞的一些特性。

Oct3/4、Sox2和Nanog是调节胚胎干细胞基因转录的3个具有代表性的转录因子，Oct3/4在胚胎干细胞中处于调节细胞全能性的顶层位置，其与Sox2、Nanog通过参与LIF-STAT、BMP、Wnt等信号传导通路，对胚胎干细胞中的管家基因进行调控，从而保持胚胎干细胞的全能性[23-24]。Erwin等发现，Oct3/4、Sox2、Nanog这3个基因在髓核祖细胞中表达，并且其在髓核祖细胞中的表达量比MSC中高[25]。

CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)是MSC和造血祖细胞的特征性表面标记，他们参与维持干细胞的自我更新和增殖。Yasen发现，在兔髓核祖细胞中CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)在RNA和蛋白水平均有明显表达，同时随着年龄的增加，表达量下降。因此，这3个基因也可以作为髓核祖细胞的鉴定标记[26]。

Notch信号传导途径在无脊椎动物和脊椎动物中广泛存在且高度保守。此途径介导由局部细胞间相互作用而产生的、对多种不成熟细胞分化的抑制信号， 在胚胎发育中起重要作用。Notch1、Jagged1是参与Notch信号传导的蛋白分子，它们在髓核祖细胞中的表达，抑制髓核祖细胞的分化，使其保持干细胞特性[26]。

此外，Sakai利用甲基纤维素半固体培养基进行集落形成实验，发现在髓核中表达酪氨酸激酶受体(Tie2)和双唾液酸神经节苷脂(GD2)的细胞具有增殖能力和分化潜能，因此,他认为这类细胞就是髓核祖细胞。进一步研究发现在髓核中存在如图1所示的分化过程[27]。

图1 髓核祖细胞分化过程

其中Tie2+GD2-CD24-和Tie2+GD2+CD24-是具有多向分化能力的祖细胞，他们都表达间充质干细胞特征性的分子CD271(>75%)[28]。CD24是髓核细胞表型，当CD24阳性时，髓核祖细胞即已分化成稳定的髓核细胞。

4 间充质干细胞向类髓核细胞分化

目前用于治疗椎间盘退变的干细胞主要有：骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、脂肪干细胞(AD-MSC)和滑膜干细胞(SMSC)。这些细胞在一定的诱导条件下能分化成类髓核细胞，上调COL2与ACAN合成。

研究发现，人BM-MSC在壳聚糖-甘油磷酸水凝胶中诱导后或者移植入牛椎间盘后，细胞成类髓核分化，COL2/ACAN值接近于髓核细胞，并且不表达成骨细胞和肥大细胞特征性表型[29]。Minogue将AD-MSC和BM-MSC诱导分化后用RT-PCR和免疫组化法检测髓核细胞阳性标记COL2A1、ACAN、PAX1及FOXF1，阴性标记IBSP、FBLN1，结果显示两种细胞均上调表达COL2A1、ACAN、PAX1、FOXF1，但是BM-MSC同时上调表达IBSP、FBLN1，表现出类似于软骨细胞的特点，而AD-MSC却不表达[9]。以上结论在一定程度上说明，AD-MSC分化后与髓核细胞的标记更吻合，进而推断AD-MSC可能是更适合的种子细胞。体外研究已证实SMSC在与髓核细胞共培养时具有类髓核分化能力[30]，但是其分化后的表型谱目前暂无报道。综上所述，深入认识髓核细胞的表型特征有助于理解间充质干细胞在髓核微环境中的分化过程与修复机制。

5 展 望

目前关于鉴定髓核细胞还没有一个统一的标准，髓核细胞在椎间盘中具有软骨样细胞作用，同时又表达脊索细胞特性，并且在椎间盘特殊的微环境中表达特定的表型。这些特性是未来确定髓核细胞表型的基础。此外，不容忽视的是髓核中存在髓核祖细胞，这类细胞可能是未来椎间盘退变生物学治疗的重要种子细胞。

目前用于椎间盘退变生物学治疗的种子细胞主要是间充质干细胞，虽然它可以分化为具有功能的类髓核细胞，但是这种类髓核细胞与正常髓核细胞的表型特点并不能完全吻合。因此，对髓核细胞表型的准确全面认识，是未来进一步寻找最适种子细胞以及探索其最适分化条件的前提。

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2014-11-01

2014-12-29

国家自然基金资助项目(81272035，81201423)；中央高校基本科研业务费专项资金和江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(KYLX_0202)

蔡峰(1987-)，男，江苏吴江人，在读博士研究生。E-mail: cfspine@163.com

吴小涛 E-mail: wuxiaotao@medmail.com.cn

蔡峰，吴小涛，王锋.椎间盘髓核细胞表型的研究进展[J].东南大学学报:医学版，2015，34(3)：443-447.

R681.53

A

1671-6264(2015)03-0443-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.028