胶原蛋白的改性方法概述

张云凤，杜国婷，王 煜

( 太原工业学院化学与化工系，山西 太原 030008 )

胶原蛋白（又名胶原），属于蛋白质的一种，是一种可再生动物生物质资源，世界上资源量非常大，主要存在于动物的皮、软骨、骨、韧带和血管中，是细胞外基质的主要成分。胶原是一种白色、不透明、无支链且不溶的纤维蛋白质，约占胶原纤维固体物的85%，通常情况下占动物体内蛋白质总量的25%~30%[1]，对动物机体及其器官起着支持、保护、结合以及形成界面隔断等重要作用[2]。

胶原具备独特的三股螺旋结构特征，以及良好的生物相容性和可生物降解性，使其在各个行业领域都有广阔的应用前景，但单纯的胶原蛋白存在以下缺点和不足：机械性能差，可纺性差，在体内的降解和吸收过快等[3]。因此需要对其进行改性以提高胶原基材料的机械强度、弹性模量以及耐热、耐酸和耐碱性。胶原蛋白的改性方法有很多，各种方法都有各自的优点和缺点。在保持胶原蛋白生物活性的同时，采用何种方法改性胶原蛋白使其得到新的功能，应考虑下列几点：1）提高胶原蛋白的机械性能；2）提高胶原收缩温度(Ts)和热变性温度(Td)；3）加强胶原的耐水性；4）改性胶原无细胞毒性。当前，国内外已有很多关于改性胶原蛋白的研究报告，其改性方法主要有：1）采用物理交联或使用化学交联剂交联改性；2）通过与其他天然或合成聚合物等共混改性；3）使用无机纳米黏土对胶原进行改性。

1 交联改性

交联方法是指通过共价键连接胶原蛋白分子来提高胶原纤维的力学性能和热稳定性的方法。该法可分为物理交联法、化学交联方法、生物交联法和低温等离子交联法。其中物理交联法和化学交联法是最常见的交联改性方法，生物学交联法改性的胶原蛋白主要涉及动物生命现象老化的相关研究，在研制胶原基生物材料中罕有报道。

1.1 物理交联法

物理改性可以提高蛋白膜的性能，并且避免添加有毒化学物质。通过物理手段对胶原蛋白进行交联改性的方法主要有热处理法、紫外线照射法、重度脱水法和射线照射法等。

1）利用紫外线等射线照射胶原蛋白溶液时会产生分子间交联，使其黏度增加而形成凝胶。目前常用的紫外照射法，是将胶原蛋白材料置于铝箔上，在距离254nm紫外灯20cm的高度处照射1~5h。Weadock等[4]对经由紫外线照射的改性胶原膜的力学性能和胶原酶解测试表明，交联改性后胶原蛋白膜的收缩温度(Ts)和抗胶原酶解的能力均显著高于未改性的胶原膜。

2）热处理法是最常见的物理改性方法之一。在热处理过程中，随着温度升高胶原蛋白分子的热运动加快，有益于分子间氢键、疏水键、二硫键及网络结构的形成，使胶原蛋白膜的机械性能增强，透光率增加及水蒸汽透过率下降。但是，热处理过程中温度过高、时间过长会使网络结构的稳定性减弱。郭兴凤等[5]采用热处理法改性胶原蛋白膜后，发现膜的透光率随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，而透水汽性则呈先降低后升高的趋势。

3）重度脱水法同样是常常使用的物理改性胶原蛋白的手段之一，这种方法是通过重度脱水造成胶原分子之间的交联，从而提高胶原蛋白的变性温度及其力学性能。近年来，有研究人员利用这种改性方法对胶原材料进行改性，结果表明，改性后的胶原膜生物相容性提高，水溶性降低，此外膜与成骨细胞之间的生物相容性受到了 影响[6]。

物理交联法改性胶原蛋白的优势是避免了外源性的毒性物质进入到胶原内，缺点是获得的胶原产品交联度低，均匀性较差。

1.2 化学交联法

化学改性是添加化学改性剂使胶原分子中的氨基、羧基等与改性剂的某些基团反应，与物理交联法相比，具有较高的交联度。化学交联法可以获得均一的交联产品，而且对于调节、控制胶原的各种属性较为有效。这种方法现已广泛应用于胶原蛋白的改性以提高其交联度、力学性能和生物相容性。当前，化学交联改性方法又可详细分为如下几种：使用化学试剂交联、侧链修饰、生理活性物质的固定化和酶法改性。

1）化学交联法中常用的改性剂有戊二醛[7]、甲醛、碳二亚胺、聚环氧化合物以及酰基叠氮化物[8]等。其中戊二醛是目前使用最广泛的试剂，大量的实验表明戊二醛能提供有效的交联。陈洁等人采用戊二醛改性水解胶原膜，发现随着改性剂用量的增加，膜的抗拉强度、穿刺强度和抗水、抗油能力均有明显提高。但是也有实验表明戊二醛具有一定的细胞毒性和钙化作用，因此人们希望找到一种既可以用于胶原材料的交联，形成一种稳定的、具有良好生物相容性的改性产品，又能满足低毒，无害等要求的交联剂。为实现这一目标，研究人员不断开发新的交联剂。近年来，一些具有生物相容性的交联剂，如聚环氧化物[9]、京尼平[10]、原花青素[11]、二醛葡聚糖[12]等被用于胶原蛋白膜的改性，这些物质不引入明显毒性的同时能够取得理想的交联效果。此外，金属离子如 Cr3+、Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和 Zr2+等有空的d电子轨道，具备一定的配位能力，可以与蛋白产生络合交联作用，也常用于胶原蛋白的交联改性，如钙离子可以和蛋白分子中游离的氨基作用，形成网状交联以增强机械性能。林云周等[13]制备的胶原/PVA复合纤维便以Al3+作为交联剂。

2）侧链修饰是指对胶原分子侧链上的氨基和羧基进行化学修饰以改善其电荷分布，使其获得新的性能的方法。例如将胶原氨基丁二酰化，可以使胶原带有丰富的负电荷，继而使其血小板粘附能、血纤维蛋白形成能都比未经修饰的胶原蛋白弱而具有抗血栓性；相反，若将胶原羧基甲基化使其带有丰富的正电荷，改性胶原在生理条件下血小板粘附能、活化能都比未经修饰的胶原蛋白高，生成大量血纤维蛋白，显示了更强的血栓性[3]。与化学试剂交联改性方法相比，使用侧链修饰改性胶原蛋白的研究在生物材料领域还比较少见，在此后的研究中，除适当采用化学试剂交联法对胶原蛋白进行改性外，还应考虑利用侧链的化学修饰来对胶原蛋白进行改性，如将性质不同的支链接枝到胶原分子上以赋予其新的功能与特性，研制新的改性材料并开发新的改性方法。

3）生理活性物质的固定化是以胶原为支撑体，将各种生物活性物质固定化后使用。例如，在胶原蛋白中引入表皮生长因子和成骨因子及其它生物活性蛋白，能够促进皮肤组织和骨组织的再生。

4） 酶法改性胶原蛋白。谷氨酰胺转移酶(TGase)能够诱导胶原蛋白之间产生新的交联，从而改善胶原蛋白材料的性能。姜燕等人[14]使用谷氨酰胺转移酶处理水解胶原蛋白膜，发现谷氨酰胺转移酶可以催化蛋白质产生交联，使膜的抗拉强度、断裂伸长率和表面疏水性提高，水分含量、总可溶性物质量及透光率明显下降。

化学交联法虽然可以获得均匀且较高的交联度，但也有引入外源毒性试剂、难以清除残留试剂等不足，近年来，已经研究了低温等离子体技术，辐射诱发技术等改性胶原材料的新方法。有报道[15-16]指出，使用低温等离子体技术改性胶原或胶原复合材料可以在材料表面引入不同的基团，改变材料表面的化学组成和结构，从而改变材料的性能。

2 共混改性

共混改性同样是提高胶原蛋白性能的常用方法之一，采用共混方法来制备胶原基复合材料可以使胶原与不同的高分子之间产生相互作用以改善胶原蛋白的性能。通过共混制备复合材料的方法有两类：一类为物理共混，如溶液共混、机械共混、乳液共混；另一类为化学共混，包括单体在另一种高聚物中的溶胀聚合以及互穿网络技术等。使用能够与蛋白质分子形成静电相互作用和/或氢键的聚合物与胶原蛋白共混，可以改善其可纺性。目前常用的与胶原蛋白共混的聚合物主要有两大类：天然高分子和合成高分子。

2.1 与天然高分子共混

天然高分子材料具有良好的相容性、可生物降解性等功能和性质，尤其是在近几年来，将不同天然高分子进行共混杂化的研究，使天然高分子共混物显示出其它材料无法替代的优点和性能，成为生物材料领域的一个研究热点。用于共混改性的天然高分子材料最具代表性的是天然多糖类，如淀粉[17]、壳聚糖[18]、海藻酸[19]和羧甲基纤维素[20]等；以及天然蛋白质类[21]，如蚕丝蛋白、大豆分离蛋白和酪蛋白等。裴莹等[22]依据天然资源各自的结构和性质，从改性方法和机理出发，阐述了胶原及明胶与其它天然高分子(壳聚糖、淀粉、丝素蛋白、海藻酸钠)进行共混和复合以制备新的生物复合材料方面的研究进展。史德海等[23]成功利用壳聚糖与Ⅱ型胶原进行复合从而获得了三维多孔复合支架，对其理化性能及体外降解的测定表明该材料能够作为支架载体，应用于组织工程软骨的构建。

随着对天然多糖的生物活性及功能的逐步了解，近年来在生物医学材料领域，通过天然多糖与胶原蛋白的共混对胶原蛋白进行改性的研究显著增加，这些研究中所使用的多糖主要有透明质酸(HA)、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素等。目前对胶原与这些多糖类天然高分子共混所得的复合材料比较集中的研究是用于药物释放的载体、可吸收性外科缝线、皮肤替代物、止血剂、透析膜、骨组织替代材料、医用引导组织再生材料、组织培养系统的支架等。近年来报道最多的是胶原蛋白与壳聚糖共混制备不同形式(薄膜、海绵、微胶囊、片、带等)的胶原-壳聚糖材料的研究[24-27]。

2.2 与合成高分子共混

以往研究中与胶原蛋白共混的合成高分子有很多种，其中包括可生物降解的聚乙烯醇、聚谷氨酸、聚乳酸、聚乙醇酸等，以及非生物降解性的聚乳酸甲基酯、丁烯基酯、聚酰胺及聚氨基甲酸酯等。20世纪80~90年代初，聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)与胶原的共混是最有代表性的研究，相关研究中聚乙烯醇和聚甲基丙烯酸羟乙酯主要用于与胶原复合制备水凝胶，用于软组织替代、药物缓释等[28]。近年来，随着人们对胶原蛋白以增殖细胞为首的很多生物功能的了解，使用可生物降解的聚乳酸、聚酸酐、聚乙醇酸、聚亚乙基四乙酸、聚谷氨酸等与胶原共混改性制备可吸收外科缝线、组织工程支架材料(如组织引导再生材料)的相关研究相对增加[29-30]。

3 无机纳米黏土改性

纳米颗粒由于其尺寸小、比表面积大而表现出与常规材料截然不同的性质。在与聚合物复合时，纳米颗粒的表面效应、量子效应、小尺寸效应以及协同效应，将使复合材料的综合性能有极大的提高。这类复合材料既具有高分子材料自身的优点，又兼备了纳米粒子的特异属性，因而使其在力学、催化、功能材料等领域内得到应用[31]。硅酸盐纳米黏土具有天然、独特的纳米结构，可以作为高分子聚合物的优良改性剂和增强剂。近年来，使用无机纳米黏土对高分子进行改性的研究越来越多[32-34]，生物降解高分子/层状硅酸盐复合材料也逐渐成为一种新兴的先进材料[35]。在层链状胶体颗粒体系中，目前研究较多的是蒙脱土(MMT)、凹凸棒土(ATT)和合成锂藻土(Laponite)等。

3.1 蒙脱土(MMT) [36]

蒙脱土作为一种价廉易得的材料，因其特殊的结构，在制备纳米复合材料领域起着举足轻重的作用。蒙脱土为2∶1层状硅酸盐，它的基本单元是由2个Si-O四面体和一个Al-O八面体构成，两者之间靠共用氧原子连接，层间距约为1nm 左右。蒙脱土Al-O八面体上部分的Al3+被Mg2+同晶置换，使层内表面带有负电荷，多余的负电荷通过层间吸附的阳离子来补偿，它们很容易与无机或有机阳离子进行交换。有机硅酸盐能进一步在与单体或聚合物熔体混合的过程中，剥离为纳米尺度的结构片层，均匀地分散在聚合物基体中，从而形成纳米复合材料。

3.2 凹凸棒土(ATT) [37]

凹凸棒(简称凹土)是一种具有层链状结构的含水富镁铝的硅酸盐矿物，具有独特的层链状晶体结构和非常细小的棒状、纤维状晶体形态，理论结构式为Si8O20Mg5[Al(OH)2(H2O)4·4H2O，其基本结构单元为2层Si-O四面体与1层Mg(Al)–O八面体构成的棒状单晶，直径20~70nm，长0.1~5.0 m，属于天然一维纳米材料。凹凸棒土的结构特征赋予了其独特的吸附、离子交换、流变、填充、催化等特性，且具有无毒、环境友好等特点，在化工、石油、医药、农业和环保等领域中应用广泛[38]，作为污水处理吸附剂[39]、铬鞣碱化材料[40]以及聚氨酯涂饰剂的改性剂在皮革工业中具有广阔的应用前景，越来越受到人们的重视。

3.3 合成锂藻土(laponite) [41]

laponite是在人为可控条件下用化学方法合成的具有片层结构的黏土产品，其结晶结构和组成与天然锂皂石类似，但纯度高，单分散性好，广泛应用于研究领域。近年来英、法、美和荷兰等国的科学家利用合成锂藻土作为天然黏土的模型体系进行了深入细致的理论研究[42-45]。锂藻土不溶于水，但在水中片层剥离分散，形成无色透明的胶体分散液，因而使用水作为溶剂，通过溶液共混或原位聚合等方法制备聚合物纳米复合材料易于实现。

总之，各种改性方法各有其优点与不足，此外有时使用单一的方法对胶原蛋白改性并不能满足对材料的要求，因此在胶原基材料的开发中也常常采用几种方法相结合来改性胶原蛋白。进一步开发具有生物活性的天然高分子材料与胶原共混杂化，提高胶原材料力学性能的同时增加材料的生物活性是研制胶原基新型生物材料的一个重要方向。

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